江蘇省鹽城市藥品檢驗(yàn)所（224002）王梅娟

茵梔黃注射液為茵陳提取物、梔子提取物、金銀花提取物及黃芩苷經(jīng)加工制成的滅菌水溶液，具有清熱、解毒、利濕、退黃的功能，臨床應(yīng)用于用于肝膽濕熱，面目萎黃，胸脅脹痛，惡心嘔吐，小便黃赤。急性、遷延性、慢性肝炎。臨床用藥廣泛，又常用于靜脈滴注，現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)為進(jìn)行熱原檢查，且為中藥制劑，對(duì)它進(jìn)行熱原控制有實(shí)際意義，因細(xì)菌內(nèi)毒素限值檢查具有較大的干擾性，故選用動(dòng)態(tài)濁度法測(cè)定其細(xì)菌內(nèi)毒素可消除其干擾，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，且對(duì)茵梔黃注射液進(jìn)行添加內(nèi)毒素回收試驗(yàn)及熱原檢查的對(duì)比試驗(yàn)，以此建立分析方法，現(xiàn)報(bào)告如下：

1 材料與儀器

茵梔黃注射液（批號(hào)20080903、20081107、20090109、20090206，江蘇省長(zhǎng)江藥業(yè)有限公司）；TAL 試劑（批號(hào)20080208，λ=0.03EU·ml-1，規(guī)格0.5ml·Amp-1,湛江海洋生物制品檢定廠）；細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)2008-3，70EU·Amp-1，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（批號(hào)20080208，規(guī)格10ml·Amp-1，湛江海洋生物制品檢定廠）；BET-32C 細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀（天津大學(xué)無(wú)線電廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定[1]公式為：L=K·M-1，K為規(guī)定的給藥途徑，即每人每公斤體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑為5 EU·kg-1；M為1h每公斤體重的最大給藥劑量為10ml·kg-1，計(jì)算得樣品的內(nèi)毒素限值L為0.5EU·ml-1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及可靠性[1]細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10及2倍稀釋，最終細(xì)菌內(nèi)毒素濃度分別為0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313 EU·ml-1稀釋系列；各取0.1ml分別加到預(yù)先加有0.1ml TAL試劑反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻，立即插入BET-32C細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀內(nèi)進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)，其中每一濃度重復(fù)3管。結(jié)果見(jiàn)附表1。回歸方程：lgT=3.029－0.3304lgC，其中，相關(guān)系數(shù)r=-0.9987；最低濃度λ1=0.0313 EU·ml-1，空白對(duì)照管在檢測(cè)時(shí)間外，故標(biāo)準(zhǔn)曲線成立。

2.3 干擾試驗(yàn)

2.3.1 樣品稀釋倍數(shù)計(jì)算[1]公式為：MVD=L·C·λ1-1。L為茵梔黃注射液內(nèi)毒素限值；C為1ml·ml-1；λ1為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低內(nèi)毒素濃度0.0313 EU·ml-1；計(jì)算得茵梔黃注射液最大有效稀釋倍數(shù)MVD為16倍。

2.3.2 樣品溶液配制及干擾試驗(yàn) 將復(fù)方丹參注射液用內(nèi)毒素檢查用水依次稀釋為2、4、8、16倍溶液，記為Ai液；同時(shí)另取4管，進(jìn)行同樣倍數(shù)稀釋，但在稀釋液中添加濃度為M（4λ1）的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液；作為樣品添加內(nèi)毒素陽(yáng)性對(duì)照管，記為Bi液；分別取上述各液0.1ml，加入預(yù)先加有0.1ml TAL試劑的反應(yīng)管內(nèi)，混勻立即插入BET-32C細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，其中每一個(gè)濃度重復(fù)3管，計(jì)算回收率。回收率（%）=（Bi液內(nèi)毒素值-Ai液內(nèi)毒素值）×M-1×100%。結(jié)果見(jiàn)附表2。標(biāo)準(zhǔn)曲線：lgT=3.029-0.3304lgC，r=-0.9987。樣品的添加內(nèi)毒素平均回收率均在50%～200%范圍內(nèi)，符合中國(guó)藥典2000年版規(guī)定，表明樣品的4個(gè)濃度溶液對(duì)鱟試劑無(wú)干擾影響。

2.4 樣品溶液正式試驗(yàn) 分別取4批茵梔黃注射液，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水制成4倍稀釋液，記為Ai液；同時(shí)另取4管進(jìn)行4倍稀釋，并在稀釋液中添加濃度為M（4λ1）的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，記為Bi液；分別取上述各液0.1ml，加入0.1ml TAL試劑的反應(yīng)管進(jìn)行檢測(cè)，其中每一個(gè)濃度重復(fù)3管，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)附表3。標(biāo)準(zhǔn)曲線：lgT=2.928-0.3027lgC，r=-0.9988，4批復(fù)方丹參注射液的回收率均在50%～200%范圍內(nèi)，表明茵梔黃注射液在本實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)TAL試劑無(wú)干擾影響，因此日常檢驗(yàn)選用4倍即可。同時(shí)進(jìn)行4批供試品的家兔熱原檢查對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果一致，均為陽(yáng)性。

附表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性（n=3）

附表2 茵梔黃注射液的干擾試驗(yàn)（n=3）

附表3 茵梔黃注射液正式干擾試驗(yàn)（n=3）

3 討論

3.1 從茵梔黃注射液的干擾試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：茵梔黃注射液用細(xì)菌內(nèi)毒素動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)，由于內(nèi)毒素回收率在50%～200%范圍內(nèi)，表明不存在干擾因素影響，且4批茵梔黃注射液的內(nèi)毒素含量均在規(guī)定限度0.5EU·ml-1以下。

3.2 用傳統(tǒng)的家兔法檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素，由于操作復(fù)雜，影響因素多，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響很大。利用動(dòng)態(tài)濁度法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、檢測(cè)靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，尤其避免了由于家兔差異及人為主觀判斷所出現(xiàn)的假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。經(jīng)過(guò)對(duì)比試驗(yàn)，樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(cè)結(jié)果與家兔熱原檢測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明使用細(xì)菌內(nèi)毒素動(dòng)態(tài)濁度法測(cè)定復(fù)方丹參注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素是可行的，可用細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢查法代替家兔熱原檢查法。