徐麗麗，沈煜，鮑曉明

山東大學(xué) 微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100

釀酒酵母纖維素乙醇統(tǒng)合加工(CBP)的策略及研究進(jìn)展

徐麗麗，沈煜，鮑曉明

山東大學(xué) 微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100

木質(zhì)纖維素乙醇的統(tǒng)合生物加工過程(Consolidated bioprocessing，CBP)是將纖維素酶和半纖維素酶生產(chǎn)、纖維素水解和乙醇發(fā)酵過程組合或部分組合，通過一種微生物完成。統(tǒng)合生物加工過程有利于降低生物轉(zhuǎn)化過程的成本，越來越受到研究者的普遍關(guān)注。釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae是傳統(tǒng)的乙醇發(fā)酵菌株。介紹了影響外源基因在釀酒酵母中表達(dá)水平的因素，纖維素酶和半纖維素酶在釀酒酵母中表達(dá)研究進(jìn)展及利用釀酒酵母統(tǒng)合加工纖維素乙醇的策略。

木質(zhì)纖維素，統(tǒng)合生物加工，纖維素酶系，纖維素乙醇，釀酒酵母

Abstract:Ethanol production from lignocelluloses of consolidated bioprocessing(CBP)is a system in which cellulase and hemicellulase production, substrate hydrolysis, and fermentation are combined or partially combined by ethanologen microorganisms that express cellulolytic or hemicellulolytic enzymes or engineering cellulolytic microorganisms with ethanol production properties.Due to its potential for significant cost reduction, CBP is receiving more and more attention.In this review article, we discuss the factors that influence the expression level of cellulases inSaccharomyces cerevisiaeand updated progress in bioethanol production from lignocellulose by the CBP strategy using the yeast species.

Keywords:lignocelluloses, consolidated bioprocessing, cellulases, lignocellulosic ethanol,Saccharomyces cerevisiae

新型能源的開發(fā)利用是當(dāng)目前人類面對(duì)能源、環(huán)境及糧食等問題所采取的積極措施，作為主要生物能源的燃料乙醇，由于其獨(dú)特的車用性質(zhì)而受到廣泛關(guān)注。利用豐富廉價(jià)的可再生木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇，是規(guī)模化發(fā)展車用燃料乙醇的基礎(chǔ)。木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的可再生資源，占地球總生物量的40%左右，高效、廉價(jià)地利用木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為如燃料乙醇等化工產(chǎn)品，是由石油基向生物基經(jīng)濟(jì)社會(huì)過渡的基礎(chǔ)。

木質(zhì)纖維素中單純由葡萄糖組成的纖維素所占的比例最高，為 33%～51%，但其復(fù)雜的晶體結(jié)構(gòu)為纖維素乙醇加工過程增加了困難，一般情況下，可以通過部分水解木質(zhì)素和半纖維素，破壞纖維素結(jié)晶結(jié)構(gòu)的理化預(yù)處理過程來解決。在此基礎(chǔ)上，通過糖化酶(纖維素酶與半纖維素酶)對(duì)纖維素和半纖維素的水解以及微生物對(duì)己糖、戊糖的乙醇發(fā)酵，完成纖維素乙醇生產(chǎn)過程。一般情況下，糖化和發(fā)酵2個(gè)步驟可以通過同步糖化發(fā)酵(Simultaneous saccharification and fermentation，SSF)或同步糖化共發(fā)酵(Simultaneous saccharification and cofementation，SSCF)的工藝一次完成。但SSF和SSCF工藝的前提是必須建立另外的纖維素酶和半纖維素酶的生產(chǎn)工藝[1]。將纖維素酶和半纖維素酶生產(chǎn)、水解和乙醇發(fā)酵組合或部分組合在一起完成，被稱為木質(zhì)纖維素乙醇的統(tǒng)合生物加工過程(Consolidated bioprocessing，CBP)，由于統(tǒng)合生物加工簡化了加工過程，降低了能耗，有利于降低生物轉(zhuǎn)化過程的成本，越來越受到研究者的普遍關(guān)注[1-3]。

自然界主要通過產(chǎn)生纖維素酶系的微生物降解木質(zhì)纖維素，不同物種的纖維素降解酶系組成及水解性質(zhì)都有很大的差異。纖維素和半纖維素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其水解涉及的酶的種類繁多(圖1)，其基本過程是纖維素在內(nèi)切葡聚糖酶(Endoglucanases，EC 3.2.1.4，來自真菌的簡稱EG; 來自細(xì)菌的簡稱Cen)和纖維二糖水解酶(Cellobiohydrolases，又稱外切葡聚糖酶，Exoglucanases，EC 3.2.1.91，來自真菌的簡稱 CBH; 來自細(xì)菌的簡稱 Cex)的協(xié)同作用下，產(chǎn)生纖維二糖和一些纖維寡糖，進(jìn)而 β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，簡稱 BG，EC 3.2.1.21)水解產(chǎn)生葡萄糖。另外預(yù)處理后未去除的半纖維素也需要在半纖維素酶的作用下產(chǎn)生糖分，最終糖分經(jīng)微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化成乙醇[2,4]。纖維素(半纖維素)酶系及降解過程的復(fù)雜性，表明實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素乙醇的CBP是有一定難度的。

圖1 纖維素(a)與半纖維素(b、c、d)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)及其水解所涉及的酶類[5-6](纖維素(a)以及阿拉伯糖糖基木聚糖(b)、半乳甘露聚糖(c)、木葡聚糖(d)等半纖維素結(jié)構(gòu)顯示存在不同形式的側(cè)鏈)Fig.1 Complex structure of cellulose and hemicelluloses and the enzymes involved in their degradation[5-6].Cellulose(a)and hemicellulose(b),(c)and(d)depicting the different side chains of arabinoxylan, galactomannan and xyloglucan, respectively.

釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae是傳統(tǒng)的乙醇生產(chǎn)菌株，具有許多優(yōu)良的生產(chǎn)性能，如在厭氧條件下較好的生長能力，能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生較高的乙醇得率和生產(chǎn)速率，具有較高的乙醇和其他抑制物耐受性，被公認(rèn)為食品安全性 GRAS(Generally Regarded As Safe)微生物等，這些優(yōu)點(diǎn)使得釀酒酵母成為統(tǒng)合生物加工研究的首選微生物，將釀酒酵母作為統(tǒng)合生物加工載體的主要要求是在釀酒酵母中高效分泌表達(dá)木質(zhì)纖維素水解酶[1]。以下綜述了影響外源基因在釀酒酵母中表達(dá)水平的因素，纖維素水解酶在釀酒酵母中表達(dá)方面的研究進(jìn)展及利用釀酒酵母統(tǒng)合加工纖維素乙醇的策略。

1 影響外源基因在釀酒酵母中表達(dá)水平的因素

外源基因在釀酒酵母中的表達(dá)水平受很多因素影響，主要從以下幾方面考慮：

1.1 外源基因的序列特性

不同生物對(duì)同一氨基酸不同密碼子的使用頻率不同，表現(xiàn)出不同的密碼子偏好性。外源基因的密碼子不一定適合釀酒酵母的密碼子偏好性，影響了外源基因的表達(dá)水平[7]，通過密碼子優(yōu)化可以提高外源基因在釀酒酵母中的表達(dá)，如 Kotula等[8]將小鼠來源的免疫球蛋白 κ鏈基因密碼子優(yōu)化成釀酒酵母偏好的密碼子，優(yōu)化的κ鏈基因在釀酒酵母F762菌株中，其合成速率提高了 5倍，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性提高了至少 50倍。Wiedemann等[9]將地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis的 L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因araA和大腸桿菌的L-核酮糖激酶基因araB、L-核酮糖-5-P-4-差向異構(gòu)酶基因araD進(jìn)行密碼子優(yōu)化，在釀酒酵母中建立優(yōu)化的L-阿拉伯糖代謝途徑，與天然基因的途徑相比，重組菌株能更好地轉(zhuǎn)化 L-阿拉伯糖。

1.2 外源基因的拷貝數(shù)

無容置疑，外源基因的拷貝數(shù)勢(shì)必影響其在釀酒酵母中的表達(dá)水平，通過不同類型的質(zhì)?？梢钥刂仆庠椿虻目截悢?shù)，例如以 2 μ質(zhì)粒自主復(fù)制區(qū)為骨架的附加體質(zhì)粒在釀酒酵母中可以維持大約100個(gè)拷貝[10-11]，而相應(yīng)的以著絲粒區(qū)為骨架的著絲粒質(zhì)粒僅能維持1～2個(gè)拷貝[12]。對(duì)于二(多)倍體、野生型釀酒酵母工業(yè)菌株而言，外源基因的穩(wěn)定高效表達(dá)是保持其生產(chǎn)特性的基礎(chǔ)，一般地，通過高拷貝整合可以實(shí)現(xiàn)。高拷貝整合策略是依據(jù)釀酒酵母高頻率同源重組的特性，利用染色體上DNA重復(fù)序列如rDNA[13-16]或δ-序列[17]作為整合位點(diǎn)。rDNA單元編碼rRNA，是酵母基因組中度重復(fù)的DNA序列，在單倍體酵母基因組中大約有 140～200個(gè)拷貝的 rDNA，這種整合方式可以使外源基因的穩(wěn)定性達(dá)到99%以上[18]；δ-序列是釀酒酵母Ty反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的長末端序列，在單倍體酵母基因中有400多個(gè)拷貝，可使更多的目的基因拷貝整合到酵母基因組中[19]。

另外，利用Cre-loxP標(biāo)記基因去除重組系統(tǒng)，可以在釀酒酵母基因組中不同的非必需 DNA區(qū)域中，或者二(多)倍體細(xì)胞的同源染色體間，反復(fù)插入外源基因，也可以實(shí)現(xiàn)定量控制外源基因多個(gè)拷貝的整合表達(dá)[20]。本實(shí)驗(yàn)室通過該系統(tǒng)，將木糖代謝的關(guān)鍵酶基因，整合在二倍體工業(yè)菌株中同源染色體上的GRE3基因區(qū)域，不僅敲除了對(duì)副產(chǎn)物木糖醇積累有關(guān)的醛糖還原酶基因GRE3，同時(shí)使外源基因表達(dá)量有所提高。

1.3 表達(dá)水平的調(diào)控

啟動(dòng)子是基因表達(dá)最重要的調(diào)控元件，通過選擇不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子可以控制外源基因的表達(dá)量，本課題組分別將釀酒酵母自身的TEF1、PGK1、HXK2和HXT7這4種不同的啟動(dòng)子置換了木酮糖激酶基因XKS1的啟動(dòng)子，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，XKS1的表達(dá)量與天然啟動(dòng)子狀態(tài)下相比，依次提高了 47.8±6.8、34.5±9.2、11.1±2.4、2.2±0.2倍，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了啟動(dòng)子對(duì)基因的表達(dá)水平的調(diào)控，但這種啟動(dòng)子的選擇并不能精確地控制基因的表達(dá)量。另外通過選擇組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以控制外源基因的表達(dá)方式，對(duì)細(xì)胞生長不利的外源蛋白，一般選用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；以追求高外源基因表達(dá)量為目的，一般選用組成型的強(qiáng)啟動(dòng)子，例如糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶啟動(dòng)子。而對(duì)于關(guān)注代謝產(chǎn)物即代謝工程研究的相關(guān)酶基因的表達(dá)，則應(yīng)控制在適當(dāng)?shù)乃?，有必要選用合適的啟動(dòng)子以及合適的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子調(diào)控每個(gè)外源基因的表達(dá)[21]。

1.4 外源基因?qū)湍讣?xì)胞生命活動(dòng)的影響

某些外源基因的高表達(dá)會(huì)影響酵母的正常生命活動(dòng)，Nakajima等[22]報(bào)道，將環(huán)狀芽胞桿菌Bacillus circulans的β-1,3-葡聚糖酶基因(bglH)在釀酒酵母中分泌表達(dá)，所分泌的β-1,3-葡聚糖酶使酵母細(xì)胞生長受到抑制并且細(xì)胞膨脹，推測(cè)由于酵母細(xì)胞壁中的β-1,3-葡聚糖被表達(dá)的β-1,3-葡聚糖酶降解導(dǎo)致細(xì)胞變小，囊泡膨脹。釀酒酵母中多個(gè)基因的共表達(dá)是釀酒酵母分子改造包括CBP酵母的所需的重要策略[23]，但在酵母細(xì)胞中表達(dá)多個(gè)外源基因，可能會(huì)增加細(xì)胞的負(fù)擔(dān)，影響細(xì)胞的生長及(或)代謝，但內(nèi)在分子機(jī)制尚不清楚。

1.5 受體菌分泌途徑及分泌過程中蛋白質(zhì)的正確加工

蛋白質(zhì)的分泌過程是在蛋白質(zhì)合成的基礎(chǔ)上，在信號(hào)肽的引導(dǎo)下，進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行折疊、糖基化等修飾，并通過質(zhì)量控制系統(tǒng)(Quality control system，QC system)檢測(cè)，正確折疊的蛋白進(jìn)入胞內(nèi)蛋白運(yùn)輸途徑及分泌后信號(hào)肽剪切過程[24]。

信號(hào)肽是蛋白分泌的必要因素。相對(duì)于許多絲狀真菌而言，釀酒酵母蛋白分泌系統(tǒng)并不強(qiáng)，常用的信號(hào)肽有酸性磷酸脂酶(PHO5)、蔗糖酶(SUC2)、α因子(MFα1)和 Killer毒素等中的內(nèi)源性信號(hào)肽[25]Kotula等[8]利用蔗糖酶信號(hào)肽，成功實(shí)現(xiàn)小鼠免疫球蛋白κ鏈的分泌表達(dá)。異源信號(hào)肽包括外源基因在天然菌株中自身的信號(hào)肽，也是外源蛋白在釀酒酵母分泌表達(dá)的常用策略。劉懷偉等[26]通過馬克斯克魯維酵母Kluyveromyces marxianus的菊粉酶信號(hào)肽(INU1A)，成功引導(dǎo)腐皮鐮孢菌Fusarium solani殼聚糖酶基因CSN的cDNA在釀酒酵母的分泌表達(dá)。Penttil?等[27]通過基因的天然信號(hào)肽，成功引導(dǎo)瑞氏木霉Trichoderma reeseiCBH II基因在釀酒酵母中的分泌表達(dá)。但有觀點(diǎn)認(rèn)為，外源蛋白自身的信號(hào)肽引導(dǎo)的蛋白分泌效率低，重組蛋白較易降解。應(yīng)該說，由于分泌蛋白自身結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)以及信號(hào)肽分泌效率的差異，對(duì)特異蛋白而言信號(hào)肽的選擇尚需要仔細(xì)研究定奪。

所有的蛋白質(zhì)都要正確折疊才能分泌行使正確功能，錯(cuò)誤折疊的分泌性蛋白不僅會(huì)被細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)偶聯(lián)的蛋白降解機(jī)制降解，還會(huì)激發(fā)胞內(nèi)的非折疊蛋白應(yīng)答機(jī)制[28]。Schr?der報(bào)道[29]超表達(dá)多個(gè)助折疊蛋白和伴侶蛋白(如Bip、PDIs等)對(duì)于不同外源蛋白的表達(dá)可能產(chǎn)生更有效的促進(jìn)作用。

胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸又叫膜泡運(yùn)輸，新合成的蛋白質(zhì)多肽鏈-核糖體復(fù)合物通過 N-末端信號(hào)肽序列與信號(hào)識(shí)別顆粒(SRP)及其受體(SR)相互作用穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的易位子隧道進(jìn)入到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中進(jìn)行進(jìn)一步的加工修飾，蛋白質(zhì)被分揀運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面過程中的每一個(gè)運(yùn)輸步驟和小泡的準(zhǔn)確定位都是由許多胞內(nèi)膜蛋白控制的，運(yùn)輸途徑中的非有效運(yùn)輸和錯(cuò)誤分揀經(jīng)常導(dǎo)致目標(biāo)蛋白滯留，其中Vps10蛋白偶聯(lián)的Golgi-to-Vacuole誤分揀途徑可能會(huì)導(dǎo)致分泌性蛋白在釀酒酵母空泡中積累[30]。有很多文獻(xiàn)報(bào)道在釀酒酵母中敲除VPS10基因?qū)τ谕庠吹鞍妆磉_(dá)有促進(jìn)作用[31-33]。

另外一個(gè)制約外源蛋白從酵母細(xì)胞中有效分泌的因素就是被宿主蛋白酶降解，這個(gè)過程容易被環(huán)境脅迫尤其是高密度發(fā)酵過程誘導(dǎo)進(jìn)行[24]。優(yōu)化培養(yǎng)條件、構(gòu)建蛋白酶缺陷型菌株，均可以減少宿主的這種特異性降解[34-36]。

蛋白質(zhì)糖基化是釀酒酵母分泌途徑中最主要的翻譯后修飾加工過程，包括O-糖基化及N-糖基化修飾，而其中在一系列作用于不同位點(diǎn)的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶的催化下，可以形成 50個(gè)以上甘露糖鏈，容易對(duì)外源蛋白造成過度甘露糖化進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的性質(zhì)[37]。

2 纖維素酶和半纖維素酶在釀酒酵母中的表達(dá)

由于釀酒酵母具有良好的將糖轉(zhuǎn)化為乙醇的發(fā)酵性能，因此釀酒酵母纖維素乙醇統(tǒng)合加工(CBP)主要的菌株改造策略是實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素水解酶類在其中的高效表達(dá)，由于纖維素酶和半纖維素酶作用的底物是不溶性的大分子，因此分泌表達(dá)是一個(gè)基本要求。

2.1 纖維素酶在釀酒酵母中的表達(dá)

纖維二糖水解酶(CBH)是從纖維素末端水解產(chǎn)生纖維二糖，外切葡聚糖酶的有效分泌是CBP酵母可行性的關(guān)鍵[5]。一般地，經(jīng)過適當(dāng)折疊的外源蛋白需要糖基化才能行使生物功能。對(duì)瑞氏木霉而言，適度的O-糖基化修飾有利于纖維素酶分泌[38]，但釀酒酵母具有獨(dú)特的糖基化修飾系統(tǒng)，容易對(duì)外源蛋白造成過度甘露糖基化[39]。糖基化修飾對(duì)于蛋白質(zhì)功能的影響有物種特異性，釀酒酵母中過度N-糖基化對(duì)外源蛋白表達(dá)的影響因蛋白而異，而纖維素酶過度糖基化主要影響其底物結(jié)合能力，也可能會(huì)影響其他方面的酶學(xué)性質(zhì)。多種來源的CBH基因已經(jīng)在釀酒酵母中成功分泌表達(dá)，并通過對(duì)受體菌的分子改造，以減少過度糖基化對(duì)CBH的影響。

Penttil?等[27]將瑞氏木霉的CBH II基因構(gòu)建到釀酒酵母表達(dá)載體上，通過其天然的信號(hào)肽在釀酒酵母中分泌表達(dá)，在5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)，培養(yǎng)基中檢測(cè)到大約有100 mg/mL CBH II蛋白，且被過度N-糖基化修飾。重組表達(dá)的CBH II能降解無定形纖維素，但與天然CBH II相比，其對(duì)微晶纖維素的結(jié)合能力下降，推測(cè)與酶的過度 N-糖基化有關(guān)。Hong等[40]將嗜熱子囊菌Thermoascus aurantiacus的CBH IcDNA在釀酒酵母 3-磷酸甘油醛脫氫酶的GAPDH基因的啟動(dòng)子的控制下，通過高拷貝附加體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化釀酒酵母，培養(yǎng)基中沒有檢測(cè)到CBH I的活性，推測(cè)是外源蛋白表達(dá)量較低。但濃縮純化后的重組CBH I在65℃條件下孵育1 h仍能保持大于 80%的初始活性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該重組酶被過度 N-糖基化，酶解去糖基化后，酶在65℃條件穩(wěn)定性明顯下降，推測(cè)過度糖基化使其熱穩(wěn)定性發(fā)生變化。

釀酒酵母中外源蛋白的過度N-糖基化是在高爾基體中由糖基轉(zhuǎn)移酶催化完成的，如可以將起始的甘露糖殘基轉(zhuǎn)移到N-葡聚糖中間體(Man8GlcNAc2)上的OCH1基因編碼的 α-1,6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、MNN1基因編碼的α-1,3-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶，MNN4基因編碼的磷酸甘露糖基轉(zhuǎn)移酶Mnn6p的正調(diào)節(jié)蛋白以及KRE2基因編碼的α-1,2-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶等一系列糖基轉(zhuǎn)移酶，其中主要是甘露糖基轉(zhuǎn)移酶。敲除釀酒酵母糖基轉(zhuǎn)移酶可以緩解對(duì)外源蛋白的過度糖基化。Nagasu等[41]敲除OCH1、MNN1和MNN4阻斷了外側(cè)糖鏈延伸，緩解外源蛋白的過度N-甘露糖基化，有利于提高酶活。Heinzelman等[42]將瑞氏木霉CBH II基因轉(zhuǎn)入敲除KRE2基因的釀酒酵母受體菌中，與出發(fā)菌株相比，其產(chǎn)生的重組CBH II大小由55 kDa左右變?yōu)?8 kDa左右。本課題組將攜帶CBH II基因的高拷貝質(zhì)粒，分別在敲除了KRE2基因的及原初的釀酒酵母實(shí)驗(yàn)室菌株中表達(dá)，前者所產(chǎn)生重組CBH II的酶活提高了約0.82倍。

相比而言，在釀酒酵母中表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶(EG)成功的例子更多，無論是真菌源的或細(xì)菌源的，酶活也比 CBH 的高幾個(gè)數(shù)量級(jí)[43-48]。Panttil?等[43]將瑞氏木霉的EG I基因和EG III基因均在PGK1啟動(dòng)子控制下，通過其天然的信號(hào)肽在釀酒酵母中分泌表達(dá)，重組酵母能向培養(yǎng)基中分泌有活性的EG I和EG III，但與天然的EG I相比，釀酒酵母產(chǎn)生的重組EG I蛋白相比分子量較大，同樣發(fā)生了不同程度的過度 N-糖基化。Mochizuki等[44]將隱球菌黃曲霉Cryptococcus fl avus的內(nèi)切纖維素酶基因CMC1在GAP啟動(dòng)子的控制下，克隆到含有δ-序列的表達(dá)載體上，通過 δ-序列整合到釀酒酵母單倍體基因組上，重組酵母分泌產(chǎn)生的 CMC酶活大約為12 500 U/L，比酶活約為1 390 U/g DCW，通過δ-序列整合表達(dá)的CMC酶活是YEp類型質(zhì)粒分泌表達(dá)的CMC酶活的1.4倍。

在纖維素降解過程中，β-葡萄糖苷酶的催化作用是一個(gè)限速步驟，可將內(nèi)切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶作用產(chǎn)生的纖維二糖降解成葡萄糖，有利于緩解纖維二糖對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶的反饋抑制[49]。Shen等[15]將扣囊腹膜酵母菌Sacchromycopsis fibuligera的 β-葡萄糖苷酶基因BGL1克隆到帶有PGK1強(qiáng)啟動(dòng)子的高拷貝整合型質(zhì)粒上，通過 rDNA區(qū)整合到釀酒酵母二倍體工業(yè)菌株N27染色體上，重組BGL1比酶活達(dá)到1.02 IU/mg總蛋白。表達(dá)BGL1基因的酵母工程菌株N227能在48 h內(nèi)將6.2 g/L纖維二糖消耗掉，產(chǎn)生3.3 g/L的乙醇，乙醇得率達(dá)到 0.532 g/g，接近理論值0.538 g/g。van Rooyen等[50]將扣囊復(fù)膜酵母菌的BGL1基因和白曲霉Aspergillus kawachii的BGL A基因分別在釀酒酵母中分泌表達(dá)，表達(dá)BGL1基因的重組酵母在含5 g/L纖維二糖的基本培養(yǎng)基中，在好氧和厭氧條件下的最大比生長速率為 0.23 h?1和0.18 h?1。

2.2 半纖維素酶在釀酒酵母中的表達(dá)

雖然一般的預(yù)處理手段可以水解木質(zhì)纖維素中的半纖維素組分，但并不能完全水解[1]，CBP釀酒酵母依然需要高效分泌表達(dá)半纖維素酶系。迄今為止，已報(bào)道若干半纖維素酶包括 β-木聚糖酶、β-木糖苷酶等木聚糖水解酶以及其他的輔助酶和脫支酶在釀酒酵母中成功表達(dá)[51-56]。

木聚糖骨架的降解需要 β-木聚糖酶、β-木糖苷酶等木聚糖水解酶的作用，這兩種水解酶均有成功表達(dá)的報(bào)道。DC la Grange等[51]將瑞氏木霉的內(nèi)切-β-1,4-木聚糖酶XYN2基因的cDNA分別在組成型強(qiáng)啟動(dòng)子PGK1和ADH2啟動(dòng)子的控制下，通過高拷貝附加體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化釀酒酵母，產(chǎn)生的 β-木聚糖酶酶活分別為160、1 200 nkat/mL。同一課題組[52]又從短小芽胞桿菌Bacillus pumilus基因組文庫中克隆得到β-木糖苷酶基因xynB，將該基因在ADH2啟動(dòng)子控制下，構(gòu)建到高拷貝附加體質(zhì)粒上，分別通過天然信號(hào)肽和釀酒酵母的MFα1信號(hào)肽分泌表達(dá)，結(jié)果表明只有利用MFα1信號(hào)肽的重組酵母能產(chǎn)生有生物學(xué)功能的 β-木糖苷酶，但重組酵母在合成培養(yǎng)基中生長 143 h時(shí)，β-木糖苷酶最大總酶活僅為0.09 nkat/mL。而同樣通過ADH2啟動(dòng)子及MFα1信號(hào)肽的分泌表達(dá)策略，黑曲霉的 β-木糖苷酶基因xlnD在釀酒酵母中得到有活性的分泌性 β-木糖苷酶[53]。進(jìn)而采用相同策略，將黑曲霉β-木糖苷酶基因xlnD及瑞氏木霉β-木聚糖酶XYN2在釀酒酵母中共分泌表達(dá)，重組酵母能產(chǎn)生酶活為1 577 nkat/mL的β-木聚糖酶和酶活為3.5 nkat/mL的β-木糖苷酶，2種酶能直接將樺木的木聚糖轉(zhuǎn)化為D-木糖[53]。

另外還需要一系列的輔助酶和脫支酶如α-D-葡萄糖醛酸苷酶、α-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶以及乙酰木聚糖酯酶和酚酸酯酶等的作用才能完全降解含多種取代基的木聚糖。Margolles-Clark等[54]在釀酒酵母中構(gòu)建了瑞氏木霉的cDNA表達(dá)文庫，將此表達(dá)文庫在含有 pNPA(對(duì)硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷)培養(yǎng)基的微孔平板中培養(yǎng)，有20個(gè)酵母克隆可以分泌 α-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶，16個(gè)克隆的cDNA為阿拉伯糖苷酶基因ABF1，而另外4個(gè)克隆為β-木糖苷酶基因BXL1，其中表達(dá)ABF1基因的酵母能從對(duì)硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷和阿拉伯糖基木聚糖中釋放 L-阿拉伯糖。Crous等[55]將黑曲霉中的α-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶基因ABF B的cDNA在PGK1強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下，通過多拷貝質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母，重組酵母能分泌有活性的 α-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶，在合成培養(yǎng)基和復(fù)合培養(yǎng)基上48 h產(chǎn)生的 α-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶最大酶活分別為0.020 U/mL和1.40 U/mL。de Wet BJM等[56]將出芽短梗霉Aureobasidium pullulans的 α-葡萄糖醛酸苷酶的基因aguA，構(gòu)建在含有ADH2強(qiáng)啟動(dòng)子的高拷貝附加體質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化釀酒酵母，重組酵母能產(chǎn)生有活性的α-葡萄糖醛酸苷酶。

總之，纖維素酶和半纖維素酶在釀酒酵母的成功表達(dá)，為CBP酵母菌株的選育奠定了基礎(chǔ)。

3 利用釀酒酵母統(tǒng)合加工纖維素乙醇的策略

利用釀酒酵母統(tǒng)合加工纖維素乙醇主要從以下幾個(gè)方面加以考慮。

3.1 纖維素水解酶在釀酒酵母中的共表達(dá)

CBP酵母需要多個(gè)纖維素水解酶的活性，通過在釀酒酵母中共表達(dá)纖維素水解酶類，建立糖化及乙醇發(fā)酵系統(tǒng)，以期實(shí)現(xiàn)纖維乙醇的統(tǒng)合生物加工，人們對(duì)此進(jìn)行了不懈的努力。Kotaka等[57]在釀酒酵母表面展示了米曲霉Aspergillus oryzae的β-葡萄糖苷酶基因 AO090009000356和內(nèi)切葡聚糖酶基因AO090010000314，重組酵母能以20 g/L β-葡聚糖作為底物進(jìn)行乙醇發(fā)酵，在 24 h內(nèi)乙醇的濃度達(dá)到7.94 g/L，乙醇的轉(zhuǎn)化率達(dá)到理論值的69.6%。Fujita等[23]成功地將瑞氏木霉的EG II基因、CBH II基因和棘孢曲霉Aspergillus aculeatus的BGL1基因在釀酒酵母表面實(shí)現(xiàn)共表達(dá)，重組菌株能夠直接利用磷酸膨脹纖維素(PASC)產(chǎn)生乙醇。Den Haan等[58]將瑞氏木霉的EG I基因和扣囊復(fù)膜酵母菌的BGL1基因，在釀酒酵母中共表達(dá)，重組菌株在厭氧條件下能在含10 g/L PASC為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長，比生長速率為0.03 h?1，細(xì)胞濃度達(dá)到0.27 g DCW/L，同時(shí)產(chǎn)生1.0 g/L乙醇。DC la Grange等[53]將黑曲霉的 β-木糖苷酶基因xlnD和瑞氏木霉的 β-木聚糖酶的基因XYN2在釀酒酵母中共分泌表達(dá)，重組酵母產(chǎn)生的β-木聚糖酶和β-木糖苷酶能直接將樺木的木聚糖轉(zhuǎn)化為D-木糖。

3.2 強(qiáng)化釀酒酵母外源蛋白表達(dá)能力

由于釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)有一定的局限性，其缺乏有效的分泌系統(tǒng)，分泌效率低，而且容易產(chǎn)生高甘露糖型的過度N-糖基化現(xiàn)象，制約著纖維素水解酶的高效表達(dá)，有必要對(duì)纖維水解酶基因及釀酒酵母受體菌的改造方面進(jìn)行改造，在不影響其他優(yōu)良特性的基礎(chǔ)上提高釀酒酵母菌株的外源蛋白表達(dá)能力。

3.3 纖維素水解酶釀酒酵母異源表達(dá)與相應(yīng)酶系的配合

我們認(rèn)為木質(zhì)纖維素乙醇的統(tǒng)合生物加工過程實(shí)質(zhì)上是通過一種微生物將纖維素酶生產(chǎn)、纖維素水解和乙醇發(fā)酵過程組合或部分組合，在釀酒酵母中共表達(dá)CBP酵母所需要的所有外源基因是不太容易實(shí)現(xiàn)的，而且不僅會(huì)增加細(xì)胞的負(fù)擔(dān)，且釀酒酵母代謝己糖和戊糖的能力也有可能受到影響。如果根據(jù)特定微生物產(chǎn)生纖維素酶系的某些不足，如瑞氏木霉 β-葡萄糖苷酶的酶活較低等，將不足組分酶的基因在釀酒酵母中高效表達(dá)，配合使用相應(yīng)的酶系的酶制劑，也是釀酒酵母統(tǒng)合加工纖維素乙醇的一個(gè)策略，能在一定程度上減少成本。如Shen等[15]將扣囊腹膜酵母菌來源的BGL1基因在釀酒酵母工業(yè)菌株中成功表達(dá)，在SSF過程中，在同一纖維素酶系JU-A10的作用系統(tǒng)中，重組菌株NAN-227的纖維二糖利用能力和從微晶纖維素的乙醇產(chǎn)生速率、得率，均優(yōu)于出發(fā)菌株NAN-27與額外添加β-葡萄糖苷酶的實(shí)驗(yàn)組。

3.4 纖維素水解酶各組分的比例

纖維素水解酶各組分的比例對(duì)木質(zhì)纖維素的酶解作用有很大影響。Gao等[59]測(cè)定了真菌和細(xì)菌的纖維素水解酶混合物作用于氨氣爆破法(AFEX)處理的玉米秸稈的酶活，發(fā)現(xiàn)某些真菌纖維素水解酶和細(xì)菌纖維素水解酶可以協(xié)同作用于葡聚糖和木聚糖，通過測(cè)定73個(gè)不同的酶混合物組合最終確定了單個(gè)酶的最佳比例，即真菌纖維素酶(占總蛋白的78%)中CBH I占總酶的9%～51%、CBH II占總酶的9%～51%、EG I占總酶的10%～50%，半纖維素酶中(占總蛋白的22%)中LX1細(xì)菌內(nèi)切木聚糖酶占總酶的13%、細(xì)菌β-葡萄糖苷酶LβX占總酶的9%；在50℃，pH 4.5條件下，酶混合物最有效，氨氣爆破法(AFEX)處理的玉米秸稈的糖化作用最佳，接近95%的葡聚糖和75%的木聚糖轉(zhuǎn)化。針對(duì)不同木質(zhì)纖維素材料不同預(yù)處理方法獲得的酶解底物，確定酶解過程需要的最佳纖維素水解酶組分的比例，不僅可以在一定程度上降低成本，避免不必要的浪費(fèi)，而且可以有效地提高酶解的效率，這也是統(tǒng)合加工纖維素乙醇的重要內(nèi)容。

4 其他CBP載體的研究進(jìn)展

其他細(xì)菌和真菌如熱纖梭菌Clostridium thermocellum、克雷伯氏桿菌Klebsiella oxytoca、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌Zymomonas mobilis、瑞氏木霉及粗糙脈孢菌Neurospora crassa等均有作為統(tǒng)合生物加工的載體的研究報(bào)道。

熱纖梭菌Clostridium thermocellum由于其表面存在多個(gè)纖維素酶的蛋白質(zhì)復(fù)合體——纖維小體，能直接將纖維素分解為乙醇，但其具有發(fā)酵不完全、發(fā)酵速度慢、乙醇產(chǎn)率較低等缺陷。Guedon等[60]通過途經(jīng)代謝工程手段強(qiáng)化了下游代謝途徑，即在熱纖梭菌中異源表達(dá)了運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因PDC和乙醇脫氫酶基因ADH II，與出發(fā)菌株相比，重組菌株細(xì)胞濃度增加了 180%，纖維素消耗增加了 150%，乙酸和乙醇得率分別增加了93%和53%，H2得率則增加了75%。

克雷伯氏桿菌Klebsiella oxytoca是一種腸道細(xì)菌，具有較寬的底物利用范圍如已糖、戊糖、纖維二糖和纖維三糖等，特別是對(duì)纖維二糖的利用特點(diǎn)可減少纖維素酶的使用。但野生型的K.oxytoca發(fā)酵產(chǎn)物主要為有機(jī)酸，乙醇產(chǎn)率較低。Ingram等[61]將歐文氏菌Erwinia chrysanthemi的2種內(nèi)切葡聚糖酶基因celY和celZ整合在K.oxytocaP2菌的染色體上，重組菌株分泌產(chǎn)生約20 U/mL的內(nèi)切葡聚糖酶到胞外，但利用該菌配合真菌纖維素酶發(fā)酵，纖維素產(chǎn)生的乙醇卻增加了22%。

運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌Zymomonas mobilis是唯一通過 ED途徑厭氧發(fā)酵葡萄糖的微生物，可以發(fā)酵葡萄糖、果糖、蔗糖等六碳糖產(chǎn)乙醇，但不能利用五碳糖生產(chǎn)乙醇。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌具有較高的糖吸收率、較高的乙醇產(chǎn)率、生物量少、較高的乙醇耐受力等。但該菌底物利用范圍過窄，一般野生型Z.mobilis菌株只能以葡萄糖、果糖和蔗糖作為生產(chǎn)乙醇的底物，不能將復(fù)雜的碳水化合物代謝為乙醇。Brestic-Goachet等[62]將歐文氏菌的內(nèi)切葡聚糖酶的基因celZ在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中表達(dá)，大部分重組內(nèi)切酶在胞質(zhì)空間中積累。Okamoto 等[63]將醋酸桿菌Acetobacter xylinum的具有羧甲基纖維素酶(CMCase)活性的基因ACM1，構(gòu)建到運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌和大腸桿菌的穿梭質(zhì)粒 pZA22上，重組質(zhì)粒pZAAC21轉(zhuǎn)化運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌和大腸桿菌，在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中的CMC酶活比在大腸桿菌中高10多倍，但75%的總CMC酶活同樣在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的胞質(zhì)空間中被檢測(cè)到。該菌株沒有在發(fā)酵纖維素產(chǎn)乙醇方面作過嘗試。

瑞氏木霉和粗糙脈孢菌不僅能夠高產(chǎn)量地產(chǎn)生多種糖化酶[64]，能有效地降解木質(zhì)纖維素，而且同時(shí)具有轉(zhuǎn)化葡萄糖和木糖產(chǎn)生乙醇的完整代謝途徑，但是其發(fā)酵速率較慢，產(chǎn)乙醇的速率和得率不高，對(duì)乙醇的耐受性也有限，同時(shí)酶產(chǎn)生的好氧及乙醇產(chǎn)生的厭氧要求的矛盾等等，制約了其作為CBP載體的發(fā)展[21]。同樣地，粗糙脈孢菌也同時(shí)具有纖維素降解及乙醇發(fā)酵能力，而且其木糖產(chǎn)乙醇的能力較瑞氏木霉稍強(qiáng)[65]，但其作為CBP載體的不足之處也與瑞氏木霉相似。

5 展望

統(tǒng)合生物加工(CBP)由于其工藝上的高度整合，有效節(jié)省了原料和時(shí)間，迎合了未來生物質(zhì)能源生產(chǎn)發(fā)展的趨勢(shì)，雖然構(gòu)建完美CBP酵母目前來說還不太現(xiàn)實(shí)，但隨著纖維素水解酶在釀酒酵母中的表達(dá)研究的不斷進(jìn)步，利用釀酒酵母生產(chǎn)纖維素乙醇的成本會(huì)進(jìn)一步降低，有關(guān)CBP酵母選育方面的研究還有很長的路要走。

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Progress and strategies on bioethanol production from lignocellulose by consolidated bioprocessing(CBP)using Saccharomyces cerevisiae

Lili Xu, Yu Shen, and Xiaoming Bao
State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, Jinan 250100, China

Received:July 4, 2010;Accepted:July 13, 2010

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China(863 Program)(No.2007AA05Z402), International Scientific Cooperation and Exchange Special Program of China(No.S2010GR0740), National Natural Science Foundation of China(No.30970091).

Corresponding author:Xiaoming Bao.Tel/Fax: +86-531-88365826; E-mail: bxm@sdu.edu.cn國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(No.2007AA05Z402)，國際科技合作與交流專項(xiàng)(No.S2010GR0740)，國家自然科學(xué)基金(No.30970091)資助。