胡亮，馮靖祎，呂穎瑩

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 醫(yī)學(xué)工程科，浙江 杭州 310003

一種新型溫控系統(tǒng)在胰島干細(xì)胞分離中的應(yīng)用

胡亮，馮靖祎，呂穎瑩

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 醫(yī)學(xué)工程科，浙江 杭州 310003

基于半導(dǎo)體變溫的溫度控制系統(tǒng)應(yīng)用于胰島干細(xì)胞分離，探索胰島干細(xì)胞分離過程溫度精密控制對(duì)胰島干細(xì)胞分離效果的影響。溫度控制系統(tǒng)利用熱電冷卻器的快速調(diào)溫功能，并利用單片機(jī)調(diào)節(jié)PID參數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)溫度的調(diào)控。采用雄性Balb/c小鼠作為供體分離胰島，比較不同的胰島分離過程溫度控制方式得到的胰島的效果差異。本溫度控制系統(tǒng)應(yīng)用后，每只小鼠胰腺分離純化后收獲量為(109±32) IEQ，胰島純度為96.2%±1.9% 。

胰島干細(xì)胞分離；PID控制；熱電冷卻器；溫度控制

本文導(dǎo)讀 >>

課題/研究背景：受浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2008F70028)資助。從供體的胰腺中獲得純度高、數(shù)量多、活力強(qiáng)的胰島細(xì)胞是進(jìn)行胰島干細(xì)胞移植的先決條件。用于胰島干細(xì)胞分離的復(fù)合膠原酶的活性和溫度是密切相關(guān)的，因此胰島及胰腺干細(xì)胞分離過程需要精確的溫度控制。本課題主要研制了一種用于胰島干細(xì)胞分離過程的溫度控制系統(tǒng)。

應(yīng)用要點(diǎn)：把胰腺的灌注與消化都集中在不銹鋼消化罐內(nèi)進(jìn)行，在供體胰腺灌注階段只要把系統(tǒng)的溫度設(shè)定到4℃即可，灌注完畢只要把系統(tǒng)的溫度設(shè)定到37℃即可，灌注與消化時(shí)間可按照實(shí)際需求來控制。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)/論文構(gòu)思：首先對(duì)系統(tǒng)的溫度控制進(jìn)行溫度實(shí)際測(cè)量，測(cè)試系統(tǒng)的溫度控制精度。采用不同的溫度控制方法對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的胰腺進(jìn)行灌注與消化，并對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠胰腺分離結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本系統(tǒng)溫度控制精確，可以提高胰島分離效果。

糖尿?。―iabetes Mellitus，DM）是一種嚴(yán)重威脅人類健康的多發(fā)性代謝疾病，而且發(fā)病率逐步上升。胰腺器官移植雖然可以有效地控制血糖代謝，提高生活質(zhì)量[1]，但胰腺移植因手術(shù)創(chuàng)傷大、外科并發(fā)癥多，治療風(fēng)險(xiǎn)較大，并非糖尿病治療的最佳方法[2]；細(xì)胞替代治療是根治胰島素依賴的糖尿病的最終手段[3]，胰島干細(xì)胞移植是實(shí)現(xiàn)患者血糖長(zhǎng)期穩(wěn)定的有效方法。目前胰島干細(xì)胞移植作為治療糖尿病的一種新方法,已經(jīng)展現(xiàn)出極其廣闊的臨床應(yīng)用前景及巨大的社會(huì)與經(jīng)濟(jì)效益[4,5]。

從供體的胰腺中獲得純度高、數(shù)量多、活力強(qiáng)的胰島細(xì)胞是進(jìn)行胰島細(xì)胞移植的先決條件[6]。用于胰島干細(xì)胞分離的復(fù)合膠原酶的活性和溫度是密切相關(guān)的，胰島及胰腺干細(xì)胞分離過程需要精確的溫度控制。目前國(guó)內(nèi)外胰島移植細(xì)胞分離溫度控制主要采用兩種方法：一種方法是通過冰袋的冷卻，在酶灌注時(shí)將溫度維持在4℃，當(dāng)進(jìn)行酶消化時(shí)再用電熱絲加熱至37℃；另外一種方法是在水浴箱上實(shí)現(xiàn)4℃和37℃的控制，水浴溫度控制下的胰島分離示意圖如圖1[7]所示。用這兩種方法來進(jìn)行胰島分離的溫度控制效果都不很理想。用第一種方法進(jìn)行溫控時(shí)，由于電熱絲的熱慣性很大，經(jīng)常發(fā)生溫度過沖，溫控精度不夠，嚴(yán)重影響了胰島細(xì)胞的分離數(shù)量和存活質(zhì)量。第二種方法雖然可以比較好地實(shí)現(xiàn)溫度控制的要求，但是水浴加熱升溫緩慢，升溫速率不高。酶的消化有時(shí)間性，過長(zhǎng)的加熱過程會(huì)降低酶對(duì)胰腺的催化效果，而且水浴方法需要管路連接，在管路上會(huì)有熱量散發(fā)，不能保證酶進(jìn)入消化罐時(shí)的溫度為37℃。

圖 1 水浴溫度控制下的胰島分離示意圖

1 半導(dǎo)體變溫的基本原理與應(yīng)用

1834年法國(guó)物理學(xué)家帕爾貼發(fā)現(xiàn)，當(dāng)有外加的直流電流流過由兩種不同材料組成的封閉回路時(shí)，并在串聯(lián)的閉合回路中通以直流電流時(shí)，在其兩端的結(jié)點(diǎn)將產(chǎn)生吸熱或放熱的現(xiàn)象，這一現(xiàn)象為帕爾貼效應(yīng)[8]。帕爾貼效應(yīng)示意圖如圖 2 所示。

接通電源后，冷端的熱量被移到熱端，導(dǎo)致冷端溫度下降，熱端溫度上升。由于半導(dǎo)體變溫元件體積小，不需要任何制冷劑，無需壓縮機(jī)、蒸發(fā)器等龐大的機(jī)械裝置。半導(dǎo)體變溫技術(shù)在低溫生物學(xué)、超導(dǎo)技術(shù)、低溫外科學(xué)、低溫電子、通訊技術(shù)、激光技術(shù)、紅外技術(shù)，以及空間技術(shù)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[9,13]。

圖 2 帕爾貼效應(yīng)示意圖

2 系統(tǒng)的溫度控制電路

本系統(tǒng)的溫度控制對(duì)象是胰島及胰腺干細(xì)胞分離的消化罐，通過鍵盤輸入消化罐工作溫度設(shè)定值，高靈敏度的熱敏電阻溫度傳感器所測(cè)量的溫度信號(hào)，經(jīng)CPU(STC12C5A60AD/S2)的A/D口進(jìn)行A/D轉(zhuǎn)換，處理器把所測(cè)得的溫度值送LCD液晶屏顯示，同時(shí)將其與鍵盤設(shè)定的溫度值進(jìn)行比較，將差值進(jìn)行PID處理后通過PWM脈寬調(diào)制控制功率輸出電路，實(shí)現(xiàn)對(duì)半導(dǎo)體制冷器的精確控制，從而構(gòu)成了實(shí)時(shí)閉環(huán)溫度控制系統(tǒng)。系統(tǒng)的溫度控制電路結(jié)構(gòu)框圖如圖3所示。

圖 3 溫度控制電路結(jié)構(gòu)框圖

3 系統(tǒng)溫度控制策略

系統(tǒng)溫度控制采用PID控制。PID控制器是一種比例、積分、微分并聯(lián)負(fù)反饋控制器。本文采用軟件脈寬調(diào)制技術(shù)，利用PID算法控制單片機(jī)輸出占空比可變的PWM信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)溫度的精確控制。

4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

我們通過對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的胰腺灌注與消化過程的溫度控制，對(duì)比傳統(tǒng)水浴法溫度控制與本系統(tǒng)溫度控制的優(yōu)越性。

4.1 材料與方法

雄性Balb/c小鼠(8～12周齡，購(gòu)至上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，中國(guó)）；膠原酶Ⅺ（Sigma公司）；Ficoll 400（Sigma-AlDrich公司）；HBSS（invitrogen公司）；電子溫度表（Fluke公司，50Ⅱ）；Legend RT低溫水平離心機(jī)（Sorvall LEGEND RT）；手術(shù)顯微鏡（江蘇鎮(zhèn)江中天光學(xué)儀器公司，LZL-6A）；體式顯微鏡（Leica S60）；DK-8D型電熱恒溫水槽(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；半導(dǎo)體變溫溫度控制系統(tǒng)（自制）。

提取胰島用鼠采用4%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.2mL/20mg體重），常規(guī)固定，消毒，小切口心前區(qū)開胸，破心放血處死。迅速“十字切口”開腹，暴露第一肝門，緊貼十二指腸乳頭處膽總管下端結(jié)扎，膽囊管部位膽總管帶線，同時(shí)在該部位30G針頭順行穿刺，針孔處帶線結(jié)扎,1～2min內(nèi)灌注2mL液體。

將兩個(gè)分離的胰腺放置在含有6mL HBSS（或含有0.5mg/mL膠原酶Ⅺ）的同一根50mL離心管內(nèi)，將裝有胰腺和6mL HBSS（或含有0.5mg/mL膠原酶Ⅺ）的50mL離心管放入37℃水浴中靜置消化，消化時(shí)間為12min，消化后將離心管迅速取出，用力振蕩10～20s使胰腺呈泥沙狀，加入4℃ 的0.1%BSA-HBSS振蕩10～20s終止消化。動(dòng)物手術(shù)一般控制在30min內(nèi)完成。

表 1 不同的胰腺分離過程溫度控制方式分離純化后獲得的胰島數(shù)量和純度

通過不同的分離過程溫度控制策略分離純化胰島，對(duì)分離出的胰島數(shù)量和活性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。采用雙硫腙特異染色法（DTZ）染色，顯微鏡下觀察胰島的純度和得率，并通過吖啶橙（AO）/碘化丙啶（PI）染色檢查分離獲得的胰島活性，比較不同的分離過程溫度控制策略分離純化胰島數(shù)量和活性。

溫度控制方法A：胰腺的灌注在底部放滿冰的不銹鋼盤子里進(jìn)行，時(shí)間為2 min；胰腺的消化在DK-8D型電熱恒溫水槽內(nèi)進(jìn)行，時(shí)間為12 min。

溫度控制方法B：胰腺的灌注在我們自制的半導(dǎo)體變溫溫度控制系統(tǒng)的消化罐里進(jìn)行，時(shí)間為2 min；胰腺的消化也在我們自制的半導(dǎo)體變溫溫度控制系統(tǒng)的消化罐里內(nèi)進(jìn)行，時(shí)間為12 min。

4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用水浴法來控制胰腺的灌注與消化過程的溫度控制，在灌注時(shí)實(shí)驗(yàn)小鼠腔內(nèi)的溫度為(6±3)℃，消化的加溫速率是12 min，恒溫效果為(37±2.5)℃；采用我們自制的半導(dǎo)體變溫溫度控制系統(tǒng)，胰腺的灌注與消化全在系統(tǒng)的消化罐內(nèi)進(jìn)行，灌注時(shí)溫度為(4±0.3)℃，消化的加溫速率是6 min，恒溫效果為(37±0.5)℃。表1是在其它條件相同的情況下不同的胰腺分離過程溫度控制方式分離純化后獲得的胰島數(shù)量和純度。

由表1可以看出在系統(tǒng)投入運(yùn)行后，胰島干細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量都有明顯的提高。可見對(duì)胰島分離過程溫度的精確控制可以提高胰島分離的數(shù)量和活性。

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Application of the Temperature Control System to Islet Stem Cell Separation Based on the Varied Temperature of Semiconductor

HU Liang,FENG Jing-yi, LV Ying-ying
Medical Engineering Department,First Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou Zhejiang 310003,China

TP273+.2；R329.2

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2010.11.005

1674-1633(2010)11-014-03

2010-08-13

2010-10-17

本文作者：胡亮，碩士，工程師，浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)生物醫(yī)學(xué)工程分會(huì)青年委員。

馮靖祎，碩士，高級(jí)工程師，中華醫(yī)學(xué)會(huì)生物醫(yī)學(xué)工程分會(huì)委員、浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)生物醫(yī)學(xué)工程分會(huì)候主任委員。

通訊作者郵箱：jingyi@mail.hz.zj.cn

Abstract:Temperature control system,based on the varied temperature of semiconductor and applied to islet stem cell separation, are utilized to explore the effect, which is caused by process of precise temperature control of islet stem cells, on the impact of islet stem cell separation. With the utilization of the fast tempering function of the thermoelectric cooler and the Single-chip Microcomputer adjusting PID parameters, temperature control systems are used to achieve the regulation of the target temperature. Male Balb/c mice were used as the donors to separate islet, and we could compare the different effects of diverse temperature control methods in the procedures of the islet separations. As a result of the application of the temperature control systems, pancreas were purified with a harvest of (109±32) IEQ and the islet purity of 96.2±1.9% of each mouse.

Key words:islet stem cell separation;PID control;thermoelectric cooler; temperature control