于 蕾， 朱 蓓 薇， 孫 黎 明， 周 大 勇， 秦 磊

( 大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

海參(Sea cucumber) 富含大量生物活性成分，如黏多糖、皂苷、β-胡蘿卜素、海膽紫酮、?；撬岬龋哂袠O高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值。但海參具有很強(qiáng)的自溶能力，給運(yùn)輸與加工造成不便及經(jīng)濟(jì)損失[1]。有報(bào)道指出，海參消化道內(nèi)存在的內(nèi)源性蛋白酶是自溶的主導(dǎo)因素。2004年，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)海參自溶酶的分離純化及性質(zhì)進(jìn)行了初步研究[2]，之后，對(duì)海參體壁組織蛋白酶[3]、酸性磷酸酶[4]及海參腸道β-1,3-葡聚糖酶進(jìn)行了系列研究，為海參自溶酶機(jī)制研究奠定了一定基礎(chǔ)。

組織蛋白酶B是存在于溶酶體中的一類(lèi)半胱氨酸蛋白酶，屬巰基蛋白酶，具有內(nèi)肽酶活[6-7]及羧肽酶活[8]。目前，對(duì)組織蛋白酶B的研究主要集中在魚(yú)類(lèi)，已從非洲鲗魚(yú)、鮐魚(yú)、大馬哈魚(yú)、鯉魚(yú)等中純化得到組織蛋白酶B。趙露露等[9]提取了海參體壁組織蛋白酶B粗酶并對(duì)酶學(xué)性質(zhì)做了研究。有關(guān)海參腸道組織蛋白酶B的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)海參腸道組織蛋白酶B粗酶的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，以期為進(jìn)一步研究組織蛋白酶B的純化及酶學(xué)性質(zhì)提供條件。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 原 料

新鮮、組織完整、無(wú)自溶的海刺參個(gè)體。

1.1.2 試 劑

N-芐酯基-精氨酸-精氨酸7-酰胺基4-甲基香豆素(N-Carbobenzoxy-Arg-Arg-MCA，Z-Arg-Arg-MCA)，7-酰胺基4-甲基香豆素(7-amido-4-methycoumarin，MCA)，美國(guó)Sigma公司；牛血清白蛋白，F(xiàn)luka Switzerland；二硫蘇糖醇(DTT)、L-半胱氨酸(L-Cys)、氯乙酸、Triton X-100、二甲基亞砜(DMSO)，上海生工生物工程有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙酸鈉、乙酸，均為分析純、市售。

1.1.3 儀 器

熒光光譜儀，Lambda 35紫外光譜儀，美國(guó)PE公司；Z-323K冷凍離心機(jī)，德國(guó)HERMLE；SP-756紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；超低溫保存箱(-80 ℃)，日本三洋公司；8050型超濾裝置，超濾膜截留分子質(zhì)量10 ku，Millipore公司。JJ200Y型精密電子天平，美國(guó)雙杰兄弟集團(tuán)有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；1810D自動(dòng)雙重純水蒸餾器，上海申生科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 樣品前處理

新鮮海刺參取其腸，去除泥沙，稱(chēng)取50 g，剪成2～3 cm的小段，加入4 ℃的200 mL浸提緩沖液，于4 ℃勻漿，充分破碎。

1.2.2 Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度

采用Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度[10]。以牛血清蛋白質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，光密度值OD500為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為Y=0.003 5X+0.012 8(R2=0.997 7)。

1.2.3 熒光法測(cè)定酶活力

1.2.3.1 紫外光譜法確定底物標(biāo)準(zhǔn)品MCA的最大吸光度值

全波長(zhǎng)掃描，檢測(cè)底物標(biāo)準(zhǔn)品MCA的最大吸光度值。最大紫外吸收值處波長(zhǎng)為346 nm。

1.2.3.2 熒光光譜法確定MCA最大熒光強(qiáng)度值

用DMSO將MCA配成10 mmol/L貯備液，激發(fā)波長(zhǎng)為346 nm的條件下，測(cè)定MCA的最大熒光強(qiáng)度值，MCA的最佳發(fā)射波長(zhǎng)為439 nm。

1.2.3.3 MCA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

以MCA濃度(μmol/L)為橫坐標(biāo)，439 nm下的熒光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為Y=892.48X+5.502 4(R2=0.999 8)。

1.2.3.4 酶活力的測(cè)定

按照Keyszer等[11]提供的方法進(jìn)行測(cè)定，并略作修改。

反應(yīng)緩沖溶液：340 mmol/L乙酸鈉、60 mmol/L乙酸、4 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(pH 5.5)，使用前配制成含8 mmol/L DTT的新鮮溶液。

終止液：100 mmol/L乙酸鈉、100 mmol/L乙酸和100 mmol/L 氯乙酸(pH 4.3)。

取待測(cè)酶液150 μL，加入75 μL組織蛋白酶B反應(yīng)緩沖溶液后在40 ℃水浴中孵育2 min，再加入75 μL底物，40 ℃孵育20 min，取出后立即加入300 μL終止液終止反應(yīng)，采用熒光光度法測(cè)定酶活力。將MCA作為酶活力測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)品?？瞻讓?duì)照為先加入終止液后，再加入酶液。

酶活力定義：能夠在1 min內(nèi)水解底物并釋放出1 μmol/L MCA產(chǎn)物的量作為一個(gè)酶活力單位[MCA 1 μmol/(L5min)]。

1.2.4 浸提緩沖液對(duì)提取組織蛋白酶B的影響

大多數(shù)蛋白酶在低離子強(qiáng)度以及偏酸性的緩沖液中具有較大的溶解度。分別稱(chēng)取50 g處理后的新鮮海參腸樣品3份，分別加入濃度為50 mmol/L的pH 3.0的NaAc-HAc緩沖液、pH 5.0的NaAc-HAc緩沖液和pH 6.8的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液各200 mL中浸提。上述浸提緩沖溶液均含5 mmol/L L-Cys和1 mmol/L的EDTA。

1.2.5 浸提時(shí)間對(duì)提取組織蛋白酶B的影響

勻漿液于4 ℃下分別靜置浸提1～12 h后，于13 500 r/min冷凍離心20 min。分別收集上清液，進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和酶活力的測(cè)定。

1.2.6 硫酸銨飽和度對(duì)提取組織蛋白酶B的影響

在最佳浸提緩沖液和最佳浸提時(shí)間提取海參腸組織蛋白酶B，經(jīng)13 500 r/min冷凍離心20 min后，取上清液，在4 ℃磁力攪拌下加入硫酸銨，使其飽和度分別達(dá)到0、20%、40%、60%、70%、80%、90%，靜置4 h后，13 500 r/min冷凍離心20 min，取上清液并分別測(cè)定酶活力。

1.2.7 透析與濃縮

硫酸銨鹽析法獲得的沉淀經(jīng)適量蒸餾水溶解，采用7 ku透析膜于4 ℃的蒸餾水中充分透析后，用截流分子質(zhì)量為10 ku的超濾膜進(jìn)行超濾濃縮，超濾時(shí)可循環(huán)加少量的去離子水以利于除鹽，濃縮好的酶液即為粗酶液，于-80 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 酶與巰基保護(hù)劑作用的研究

于獲得的粗酶液中分別加入EDTA、L-Cys、DTT、EDTA-L-Cys混合液、EDTA-DTT混合液，使EDTA的終濃度為1 mmol/L，L-Cys和DTT的終濃度為2 mmol/L，L-Cys和DTT的終濃度均呈梯度變化：依次為0.5、1.0、2.0、5.0、10、20 mmol/L。

將上述混合酶液在室溫下孵育30 min后，測(cè)定酶活力。

2 結(jié)果與討論

2.1 最適浸提緩沖液的確定

組織蛋白酶B是存在于細(xì)胞溶酶體中的一類(lèi)半胱氨酸蛋白酶。研究表明，其在弱酸性環(huán)境下易被活化，在pH 3.0～7.0 均具有活性，而在堿性條件下會(huì)發(fā)生不可逆失活。由圖1可知，50 mmol/L pH 5.0的NaAc-HAc緩沖液提取的粗酶相對(duì)酶活最高，pH 6.8的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液提取的相對(duì)酶活最低，因此含5 mmol/L L-Cys、1 mmol/L EDTA、0.2% Triton X-100的50 mmol/L pH 5.0的NaAc-HAc的緩沖液是提取組織蛋白酶B的最佳浸提緩沖液。

1. pH 3.0 NaAc-HAc緩沖液；2. pH 5.0 NaAc-HAc緩沖液；3. pH 6.8 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液

2.2 最佳浸提時(shí)間的確定

由圖2可知，浸提時(shí)間在6～10 h時(shí)，酶活力達(dá)到最大，且酶活力基本保持不變，說(shuō)明酶處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)；當(dāng)浸提時(shí)間大于10 h時(shí)，酶活力明顯變?。欢鞍踪|(zhì)含量隨浸提時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大，浸提時(shí)間在1～7 h時(shí)，蛋白質(zhì)含量明顯增大，當(dāng)浸提時(shí)間為7 h時(shí)，蛋白質(zhì)含量基本達(dá)到最大，之后蛋白質(zhì)含量基本保持不變，達(dá)到平衡。由于組織蛋白酶是一種結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的蛋白酶，本實(shí)驗(yàn)為避免不同酶形式呈現(xiàn)不同酶活力的干擾，因此選擇酶活趨于平衡的狀態(tài)，以最大限度保證酶形式一致。因此選擇7 h作為海參腸提取組織蛋白酶B的最佳浸提時(shí)間。

圖2 浸提時(shí)間對(duì)組織蛋白酶B提取率的影響Fig.2 Effect of different time on extracting efficiency of cathepsin B

2.3 最適硫酸銨飽和度的確定

由圖3可知，隨著硫酸銨飽和度的增加，上清液的酶活逐漸減小。當(dāng)硫酸銨飽和度由50%增加至70%時(shí)，上清液的酶活急劇下降；當(dāng)硫酸銨飽和度達(dá)到80%時(shí)，上清液的酶活趨近于零，且與硫酸銨飽和度90%時(shí)基本持平，說(shuō)明80%硫酸銨飽和度已將海參腸組織蛋白酶B基本全部沉淀，因此以80%硫酸銨飽和度作為組織蛋白酶B最佳鹽析條件。

圖3 組織蛋白酶B硫酸銨鹽析曲線(xiàn)Fig.3 Salting out curve of cathepsin B

2.4 巰基保護(hù)劑對(duì)酶活力的影響

由表1可知，金屬螯合物EDTA和EGTA及巰基保護(hù)劑DTT和L-Cys對(duì)酶均有一定的激活作用。當(dāng)L-Cys終濃度在0.5～5 mmol/L時(shí)，酶活逐漸變大；當(dāng)其終濃度達(dá)到5 mmol/L時(shí)，酶活基本保持不變。而隨DTT終濃度由0.5～20 mmol/L梯度變化時(shí)，酶活也逐漸增大，可見(jiàn)DTT對(duì)酶的激活作用較為明顯。說(shuō)明提取的粗酶液含有巰基基團(tuán)，符合組織蛋白酶B的特性。因此，巰基保護(hù)劑可有效地保護(hù)酶活，可用于組織蛋白酶B的提取、純化等。

表1 巰基保護(hù)劑與金屬螯合物對(duì)組織蛋白酶B酶活的影響Tab.1 Effect of sulfhydryl and metal chelating reagents on cathepsin B

3 結(jié) 論

海參腸道組織蛋白酶B粗酶最優(yōu)提取條件為：含5 mmol/L L-Cys、1 mmol/L EDTA、0.2% Triton X-100的50 mmol/L pH 5.0 的NaAc-HAc緩沖液勻漿破碎浸提7 h后，選擇80%的硫酸銨飽和度鹽析。該方法可獲得具有較高酶活的粗酶，還可有效減少分離純化過(guò)程中組織蛋白酶B活性的降低。

巰基保護(hù)劑可激活提取的粗酶液，說(shuō)明提取的粗酶含有巰基，這符合組織蛋白酶B的特性。因此在提取粗酶的過(guò)程中，可添加巰基保護(hù)劑以有效保證酶活性。

[1] 戴志遠(yuǎn). 魚(yú)類(lèi)自溶作用[J]. 浙江水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào). 1999, 9(1):51-56.

[2] 朱蓓薇,韓冰. 海參自溶酶的分離純化和部分性質(zhì)研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2004, 30(4):132-137.

[3] ZHU Beiwei, ZHAO Lulu, SUN Liming, et al. Purification and characterization of a cathepsin L-like enzyme from the body wall of the sea cucumberStichopusjaponicus[J]. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 2008, 72(6):1430-1437.

[4] ZHU Beiwei, YU Jianwei, ZHANG Zongshen, et al. Purification and partial characterization of an acid phosphatase from the body wall of sea cucumberStichopusjaponica[J]. Protein Biochemistry, 2009, 44(8):875-879.

[5] 趙軍崗,董秀萍,朱蓓薇,等. 海參腸道β-1, 3-葡聚糖酶的提取條件及其酶學(xué)性質(zhì)[J]. 大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào), 2007, 26(4):289-293.

(ZHAO Jung-ang, DONG Xiu-ping, ZHU Bei-wei, et al. Extraction, purification and characterization of β-1, 3-glucanases from the gut of the sea cucumber[J]. Journal of Dalian Institute of Light Industry, 2007, 26(4):289-293.)

[6] LEE J J, CHEN H C, JIANG S T. Comparison of the kinetics of cathepsin B, L, L-like and X from the dorsal muscle of mackerel on the hydrolysis of methlcoumarylamind substrate[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 1996, 44:774-778.

[7] SHEREKAR S V, GOR M S, NINJOOR V. Purification and characterization of cathepsin B from the skeletal muscle of fresh water fishTilapiamossambica[J]. Food Science, 1988, 53(4):1018-1023.

[8] JIANG S T, LEE J J, CHEN H C. Purification and characterization of cathepsin B from ordinary muscle of mackerel[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 1994, 42(5):1073-1079.

[9] 趙露露,董秀萍,于蕾,等. 海參體壁組織蛋白酶B酶學(xué)性質(zhì)的研究[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā). 2008, 29(8):5-8.

[10] LOWRY O H, ROSERBROUGH N J, FARR A L, et al. Protein measurements with the folin phenol reagent[J]. Peptides Biology and Chemistry, 1951, 193(4):265.

[11] KEYSZER G, LAMBIRI M, KEYSSER C, et al. Matrix metalloproteinases, but not cathepsins B, H, and L or their inhibitors in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis are potentially useful markers of disease activity[J]. Zeitschrift für Rheumatologie, 1998, 57:392-398.