關文怡 曹授俊 齊軍喆 （北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學院畜牧獸醫(yī)系 102442）

用激素處理動物進行超數(shù)排卵是進行胚胎移植、轉基因、克隆等研究的基礎之一，通過超數(shù)排卵獲得大量整齊、優(yōu)質的卵子或受精卵是胚胎移植的關鍵技術之一。近年來，隨著遺傳工程小鼠的大量開發(fā)，人們對小鼠卵母細胞和受精卵的需求量日趨增多，因而完善的超數(shù)排卵技術是遺傳工程小鼠研究獲得成功的重要前提條件。本試驗在雌鼠的年齡與體重、激素的注射時間等因素不變的條件下，以129/J小鼠為試驗材料，對注射不同劑量的PMSG和HCG對小鼠進行超數(shù)排卵試驗，并分析獲得卵母細胞的數(shù)量和質量。

1 材料和方法

1.1 試驗動物 5～6周齡129/J雌性小鼠30只和8周齡129/J雄性小鼠(中國醫(yī)學科學院試驗動物研究所)。

1.2 試驗器械 實體顯微鏡Nikon SM2645(日本Nikon公司)；手術器械：剪毛剪、手術剪、鑷子等；口吸式移卵管。

1.3 試驗試劑 試驗超數(shù)排卵激素(PMSG，HCG)均購自寧波市激素制品有限公司；其余試劑除特殊說明外均為Sigma(Sigma Chemical, St.Louis, MO, USA)公司產(chǎn)品。

1.4 試驗方法 選用5～6周齡的129/J雌鼠30只，自由采食和飲水，室溫20±2℃，控光(光照14h/d，6:00～20:00)。經(jīng)過1周的適應性飼養(yǎng)后，按照注射劑量不同分別分為A組(PMSG 2.5IU，HCG 2.5IU)、B組(PMSG 5.0IU，HCG 5.0 IU)、C組(PMSG 7.5IU，HCG 7.5IU)，每組10只。每只小鼠腹腔注射PMSG，間隔48h后分別注射HCG進行超數(shù)排卵，再與性成熟同系公鼠合籠，次日早上檢查陰道栓，有栓雌鼠以頸椎脫臼法處死。將輸卵管摘除置于盛有M2培養(yǎng)液的表面皿中，在實體顯微鏡下找到輸卵管膨大部，用1m1注射器沖洗輸卵管，再用移卵管收集卵母細胞。超數(shù)排卵處理后，對不同處理組的雌鼠進行卵母細胞計數(shù)。

1.5 統(tǒng)計分析 利用SPSS對129/J小鼠不同劑量組的平均取卵數(shù)采用單因素方差分析進行檢驗。

2 結果

本試驗分為A、B、C3個劑量組，獲得卵子數(shù)量如表1所示。129/J小鼠C組的平均取卵數(shù)極其顯著的高于A組和B組的平均取卵數(shù)；B組與A組的平均取卵數(shù)差異不顯著。

表1 129/J小鼠超數(shù)排卵試驗結果

3 分析與討論

哺乳動物發(fā)情周期中給予大量外源FSH 或類似物，可誘發(fā)大量卵母細胞發(fā)育，排卵數(shù)可超過正常排卵數(shù)的若干倍[1]。在小鼠的超排試驗中，一般用孕馬血清促性腺激素PMSG模仿內(nèi)源性促卵泡素FSH的促進卵成熟作用，人絨毛膜促性腺激素HCG模仿促黃體素LH的誘導作用。超數(shù)排卵有成功與否取決于雌鼠的年齡與體重、激素的劑量和注射時間以及小鼠的品系。

關于小鼠超數(shù)排卵的最適合的激素劑量，目前國外多采用PMSG與HCG各5IU[2]或各7.5IU[3]劑量，國內(nèi)有的采用PMSG與HCG各5IU[4]或各10IU[5]劑量的方法，也有采用PMSG與LH超排小鼠的報道[6]。由此可知，激素劑量方面的研究結果還有一定的差異。這可能與超數(shù)排卵受到多種因素的影響有關。對于大多數(shù)品系小鼠推薦的PMSG劑量是腹腔注射5IU，但對有些品系小鼠2.5IU或多達10IU效果可能更好。李子義等[7]在不同激素劑量對幼鼠超數(shù)排卵及超排卵質量的影響中報道以PMSG與HCG各10IU劑量對5～6周齡小鼠進行超排，結果排卵數(shù)分別是42.2枚和40.2枚。另一種促性腺激素是HCG用來誘發(fā)成熟卵泡破裂，HCG的一般注射劑量為5IU，但對某些品系小鼠來說，適合的劑量可能在2.5IU～10IU之間。本試驗選用5～6周齡的129/J雌鼠，采用激素3種不同劑量組合在自由采食和飲水，室溫20±2℃，控光(光照14h/d，6:00～20:00)的條件下采用PMSG 7.5IU，HCG 7.5IU劑量組合排卵數(shù)顯著高于其它組，為較好的超數(shù)排卵方案。

小鼠超數(shù)排卵效果除與激素劑量不同有關外，可能與試驗小鼠個體的日齡、發(fā)情周期、體重及營養(yǎng)狀況有關。

[1]王建辰. 家育生殖內(nèi)分泌學[M]. 北京:農(nóng)業(yè)出版社,1991. 64.

[2] Kodayashi K,Okuyama M, Fujimoto G,et al . Subzonal insemi2nationwith asingle spematozoon using manipulation assisted sperm adhesion onto theooplasmic membrance in mouse ova [J]. Mol. Rprod Dev, 1992,31: 223～229.

[3]Kimura Y, Yanagimachi R. Mouse oocytes In jected with testl2 cularspermatozoa or round spermatids can develop into normal off spring[J]. Development ,I995 ,121 :2397～2405.

[4]李秦,朱德生,劉玉林,等. 不同激素對哺乳動物超數(shù)排卵作用的研究[J]. 實驗動物科學與管理, 1997, 14 (3):126.

[5]劉紅林,范必勤,陳宜峰等. 小鼠卵母細胞的乙醇激活[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學學報, 1996 ,19 (4) :56-60.

[6]錢菊汾. PMSG配合L H 促使小鼠超數(shù)排卵效果分析[J]. 北京農(nóng)學院學報, 2000 ,15 (1) :25-28.

[7]李子義,譚景和,孫興參等. 不同激素劑量對幼鼠超數(shù)排卵及超排卵質量的影響[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 1999, (3): 224.