尹淑麗,張麗萍,梁 然,黃亞麗,張 蕾,段普凡＊

(1.河北省科學(xué)院生物研究所,河北石家莊 050081;2.鹿泉銅冶農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣區(qū)域站,河北鹿泉 050200)

柿葉黃酮對(duì)BSD-2菌株芽胞數(shù)量及抑菌活性的影響

尹淑麗1,張麗萍1,梁 然2,黃亞麗1,張 蕾1,段普凡1＊

(1.河北省科學(xué)院生物研究所,河北石家莊 050081;2.鹿泉銅冶農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣區(qū)域站,河北鹿泉 050200)

研究PB液體培養(yǎng)基中加入不同濃度的柿葉黃酮對(duì)內(nèi)生枯草芽胞桿菌生長(zhǎng)、芽胞形成及抑菌活性的影響,利用光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)、稀釋平板法統(tǒng)計(jì)芽胞數(shù)量、平板擴(kuò)散法和病原菌生物測(cè)定的方法測(cè)定抑菌效果。結(jié)果表明,加入柿葉黃酮濃度為0.5%的處理對(duì)菌體生長(zhǎng)無(wú)影響,使芽胞數(shù)量提高100倍,同時(shí)增強(qiáng)對(duì)灰霉、黑斑、黃萎病原菌的抑菌效果。

柿葉黃酮;芽胞數(shù)量;抑菌活性

植物病害是影響農(nóng)業(yè)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)的主要因素之一,目前主要采用化學(xué)方法進(jìn)行防治,但化學(xué)殺菌劑過(guò)量會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染、破壞生態(tài)平衡、誘導(dǎo)病原菌產(chǎn)生抗藥性,它的殘留問(wèn)題也令人擔(dān)憂,因此植物病害的生物防治研究越來(lái)越受到重視。病害生物防治的關(guān)鍵是高效生防菌株的獲得,內(nèi)生菌長(zhǎng)期生活在植物體內(nèi)與植物協(xié)同進(jìn)化,一方面植物體為其提供生長(zhǎng)必需的能量和營(yíng)養(yǎng);另一方面,內(nèi)生細(xì)菌又可通過(guò)自身的代謝產(chǎn)物或借助于信號(hào)傳導(dǎo)作用對(duì)植物體產(chǎn)生影響[1]。近年來(lái)對(duì)內(nèi)生菌在植物病害生物防治方面的應(yīng)用成為研究的熱點(diǎn),Chen[2]、Brooks[3]、夏正俊[4]、吳藹民[5]和林玲[6]從植物組織內(nèi)分離到內(nèi)生細(xì)菌,對(duì)植物病原真菌有較好抑制作用,防治效果較好。本試驗(yàn)室從健壯植物組織中分離到1株枯草芽胞桿菌BSD-2,抑菌譜較寬,其芽胞制成的生物菌劑及代謝產(chǎn)物制成的葉面噴施劑對(duì)植物的土傳、氣傳病害的抑制作用較好,且取得了一定的應(yīng)用效果,因此提高益生菌株BSD-2芽胞的數(shù)量及代謝產(chǎn)物的抑菌活性成為生產(chǎn)生防制劑的重要環(huán)節(jié)。柿樹(shù)是我國(guó)北方的重要經(jīng)濟(jì)作物之一,隨著對(duì)柿葉的化學(xué)成分和生理活性的研究越來(lái)越深入,發(fā)現(xiàn)柿(D iospyros kakiL inn)葉的黃酮類物質(zhì)是最主要有效成分之一[7],具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、發(fā)育、開(kāi)花、結(jié)果及抗菌防病的效果。隨著對(duì)柿葉黃酮認(rèn)識(shí)和效果的肯定,黃酮提取和含量測(cè)定方面[8-13]及在植物栽培中的應(yīng)用等方面的研究逐漸增多,但柿葉黃酮對(duì)益生芽胞桿菌芽胞數(shù)量及代謝產(chǎn)物抑菌活性方面的研究少有報(bào)道。本研究采用石家莊山區(qū)柿子產(chǎn)地的柿葉,提取柿葉粗黃酮,探討它的加入對(duì)內(nèi)生枯草芽胞桿菌BSD-2菌株芽胞數(shù)量及代謝產(chǎn)物抑菌活性的影響,為提高微生物制劑的生防效果奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 柿葉 黃酮的提取參照馬桂榮[12]的方法,1 g干柿子葉可提取粗黃酮0.04 g。

1.1.2 供試菌株 枯草芽胞桿菌(B acillus subtilis)BSD-2、黃瓜灰霉(B otrytis cinerea)、梨黑斑(A lternaria kikuchiana)、棉花黃萎(Verticillium wilt)病植物病原菌為該實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.3 培養(yǎng)基 ①PB培養(yǎng)基:牛肉膏0.5%,蛋白胨1%,氯化鈉0.5%,瓊脂粉1.2%,pH 7.2～7.4(不加瓊脂粉即為PB液體培養(yǎng)基);②PDA培養(yǎng)基:土豆20%,葡萄糖2%,瓊脂粉1.2%,pH自然。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 設(shè)置5種不同柿葉黃酮的加入濃度,處理1加入濃度為5%,處理2加入1%,處理3加入0.5%,處理4加入0.25%,處理5液體PB培養(yǎng)基為對(duì)照,每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)采用液體PB培養(yǎng)基,250 mL三角瓶裝量為50 mL。種子液培養(yǎng)15 h時(shí)轉(zhuǎn)接,按5%的接種量接種,30℃、200 r/min,培養(yǎng)48 h,培養(yǎng)液待用。

1.2.2 測(cè)定內(nèi)容 ①菌體形態(tài)觀察:將培養(yǎng)48 h的培養(yǎng)液固定、染色后,于光學(xué)顯微鏡下放大1000倍觀察菌體形態(tài);②芽胞數(shù)量統(tǒng)計(jì):將不同處理的培養(yǎng)液置于80℃水浴10 min后,取1 mL接入99 mL無(wú)菌水中稀釋,直至稀釋終濃度達(dá)到10-6、10-7、10-8,吸取0.1 mL稀釋液涂布PB平板,活菌計(jì)數(shù)。

1.2.3 抑菌活性的測(cè)定 將各處理的培養(yǎng)液離心后,經(jīng)0.22μm的濾膜過(guò)濾除菌,以灰霉病原菌為指示菌,采用平板擴(kuò)散的方法,測(cè)定不同處理對(duì)代謝產(chǎn)物抑菌活性的影響。

1.2.4 對(duì)病原菌抑菌率的測(cè)定 試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)處理,加入濃度1%、0.5%、0.25%的3個(gè)不同濃度處理,PB培養(yǎng)基對(duì)照處理,PDA培養(yǎng)基空白對(duì)照處理。將1%、0.5%、0.25%、PB培養(yǎng)基對(duì)照4個(gè)處理的除菌濾液,以10%的濃度加入到固體PDA培養(yǎng)基中制成含藥培養(yǎng)基。以灰霉、黑斑、黃萎3種病原菌為指示菌,采用病原菌菌餅生長(zhǎng)量測(cè)定的方法測(cè)定抑菌率。

2 結(jié) 果

2.1 不同柿葉黃酮加入濃度對(duì)內(nèi)生枯草芽胞桿菌菌體生長(zhǎng)及芽胞數(shù)量的影響

表1 不同處理的菌體形態(tài)Table 1 The cellmorphology of different treatment

圖1 菌體自溶及變形Fig.1 The cell deformation and autolysis

圖2 正常芽胞Fig.2 The normal spores

由表1可見(jiàn),柿葉黃酮加入濃度為5%時(shí),內(nèi)生枯草芽胞桿菌BSD-2的菌體不能正常生長(zhǎng),在菌體生長(zhǎng)調(diào)整期時(shí)發(fā)生菌體自溶(圖1),導(dǎo)致不能形成芽胞。其他濃度處理對(duì)菌體形態(tài)及芽胞的形成無(wú)影響,可形成正常的芽胞(圖2)。

圖3 不同處理對(duì)芽胞數(shù)量的影響Fig.3 The number of spores of different treatment

由圖3可知,柿葉黃酮加入濃度為1%、0.5%、0.25%的處理芽胞數(shù)量明顯高于對(duì)照,并且柿葉黃酮的加入量與芽胞數(shù)量呈正向關(guān)系;與對(duì)照的芽胞數(shù)量相比,加入濃度1%、0.5%的處理可以提高100倍。

2.2 不同處理對(duì)代謝產(chǎn)物抑菌活性的影響

圖4 抑菌效果Fig.4 The inhibitory effects

由圖4可知,加入濃度為5%的處理對(duì)灰霉病原菌沒(méi)有抑制作用,加入濃度為1%和0.25%的處理對(duì)灰霉病的抑制作用較小,加入濃度為0.5%的處理抑菌效果與對(duì)照PB培養(yǎng)基處理相當(dāng)。可見(jiàn),在液體培養(yǎng)基中添加不同濃度柿葉黃酮,可影響內(nèi)生枯草芽胞桿菌代謝產(chǎn)物的抑菌活性,加入濃度為5%、1%和0.25%的處理對(duì)代謝產(chǎn)物的抑菌活性有降低的影響,而加入濃度為0.5%的處理對(duì)代謝產(chǎn)物的抑菌活性無(wú)影響。

2.3 對(duì)病原菌抑制率的影響

圖5 不同處理對(duì)灰霉抑菌率的影響Fig.5 The antibacterial rate of different treatment to the Botrytis cinerea

圖6 不同處理對(duì)黑斑抑菌率的影響Fig.6 The antibacterial rate of different treatment to the Alternaria Kikuchiana

圖7 不同處理對(duì)黃萎抑菌率的影響Fig.7 The antibacterial rate of different treatment to the Verticillium wilt

由圖5、6、7可知,液體PB培養(yǎng)基中加入0.5%的柿葉黃酮,利于內(nèi)生枯草芽胞桿菌抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生,可明顯提高對(duì)灰霉病、黑斑、黃萎原菌的抑菌率。加入0.25%的柿葉黃酮,對(duì)黑斑病原菌的抑菌率與對(duì)照相當(dāng),對(duì)灰霉、黃萎的抑菌率明顯低于對(duì)照;加入1%的柿葉黃酮,對(duì)灰霉、黃萎的抑菌率與對(duì)照相當(dāng),對(duì)黑斑的抑菌率明顯低于對(duì)照。

3 討 論

柿葉黃酮可提高內(nèi)生枯草芽胞桿菌BSD-2菌株的芽胞數(shù)量,在液體培養(yǎng)基中加入濃度1%、0.5%、0.25%的柿葉黃酮,隨柿葉黃酮加入量的增加,芽胞的數(shù)量增加,且呈現(xiàn)正相關(guān)?？梢?jiàn)柿葉黃酮可提高內(nèi)生枯草芽胞桿菌BSD-2菌株的芽胞數(shù)量。不同柿葉黃酮的加入濃度對(duì)內(nèi)生枯草芽胞桿菌BSD-2菌株代謝產(chǎn)物抑菌活性的影響不同,加入0.5%的柿葉黃酮可明顯提高對(duì)灰霉、黑斑、黃萎病原菌的抑菌率?？梢?jiàn)在內(nèi)生枯草芽胞桿菌生長(zhǎng)過(guò)程中柿葉黃酮能夠協(xié)助抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生,使得其抑菌活性增強(qiáng)。

該菌株代謝產(chǎn)物中的抑菌活性物質(zhì)是一種穩(wěn)定性較好的小肽[14],適于作為液體噴施劑用于植物真菌病害的生物防治中。該菌株是內(nèi)生枯草芽胞桿菌,作為生防菌劑在土壤中定植后利于在植物體內(nèi)的定植、傳導(dǎo),充分發(fā)揮其抑菌作用。

柿葉黃酮的加入在有效提高該菌株芽胞數(shù)量的同時(shí),也提高了該菌株抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生,對(duì)提高由該菌株研制的生防菌劑的殺菌效果具有較大潛力。我國(guó)柿葉資源廣闊,有效加以利用既可降低生物殺菌劑生產(chǎn)的成本,又可有效利用廢棄的生物質(zhì)資源。

本研究為柿葉黃酮在微生物生防制劑生產(chǎn)上的廣泛應(yīng)用提供理論基礎(chǔ),為進(jìn)一步深入研究奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。對(duì)于柿葉黃酮提高芽胞數(shù)量和增強(qiáng)代謝產(chǎn)物抑菌活性的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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The Effect of Persimmon Flavone on Spores Number and Antibacterial Activity of BSD-2

YIN Shu-li1,ZHANG Li-ping1,LIANG Ran2,HUANG Ya-li1,ZHANG Lei1,DUAN Pu-fan1
(1.Inst.of Biol.,Hebei Acad.of Sci.050081;2.Luquan Tongye Regional Agrotechnical Sta.,050200)

Different concentrations of persimmon flavone(pf)were added to PB liquid medium to study its effects on the growth,sporulation,and antimicrobial activity of Bacillus subtilis,cell morphology was observed through optical microscope,the number of spores was counted by the traditional dilution plate method,inhibitory effects was tested by the plate diffusion method and pathogenic organisms determination.The results showed that the treatment of pf at 0.5%had no effect on the growth of the cells and made the number of spores increased 100 times,while enhancing the antibacterial effect on the Botrytis cinerea,Alternaria kikuchiana,and Verticillium wilt.

persimmon flavone;spore number;antimicrobial activity

Q93

A

1005-7021(2010)06-0047-04

河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(08215501D);河北省財(cái)政預(yù)算項(xiàng)目(10307);河北省基金項(xiàng)目(C110412)

尹淑麗 女,碩士,助理研究員。主要從事利用微生物生物防治真菌病害的工作。E-mail:yslbaihelr@126.com

＊通訊作者。Tel:0311-83014879,E-mail:hbsjzddll@yahoo.com.cn

2010-10-13;

2010-11-22