李素杰，周 瑾，王海松，馬勝輝，龔明玉(.承德醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系007級(jí)，河北承德 067000;.承德市中心醫(yī)院腫瘤外科;.指導(dǎo)教師）

原發(fā)性肝癌是我國常見惡性腫瘤之一，在各種惡性腫瘤的死亡順序中居第二位，每年死亡20多萬人，約占世界肝癌死亡人數(shù)的一半以上[1]。惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的過程，是細(xì)胞的過度增殖和細(xì)胞凋亡受到抑制的過程[2]。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡已成為治療腫瘤的一個(gè)新熱點(diǎn)。應(yīng)用加熱治療腫瘤早已被臨床所接受，但加熱對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響未見報(bào)道。為此，我們以肝癌HepG2細(xì)胞為模型，觀察不同加熱時(shí)間對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株HepG2:購自南京凱基生物科技有限公司，為單層貼壁生長。培養(yǎng)液為RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO公司產(chǎn)品），內(nèi)含10%新生牛血清，100u/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素。將HepG2細(xì)胞置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至指數(shù)生長期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隔2-3d傳代一次，細(xì)胞消化液為0.25%的胰酶。

1.2 細(xì)胞處理及分組 取生長狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞若干瓶，采用隨機(jī)對(duì)照原則分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。(1）對(duì)照組:即加熱0h組(正常培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞）;(2）實(shí)驗(yàn)組:根據(jù)加熱時(shí)間不同分為3組:即加熱0.5h組、加熱1h組、加熱1.5h組。將恒溫水浴箱調(diào)至所需溫度43℃對(duì)細(xì)胞進(jìn)行加熱，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞熱療后，棄上清，加入5ml新鮮培養(yǎng)基，置37℃繼續(xù)培養(yǎng)24h。

1.3 膜聯(lián)蛋白(Annexin-V-EGFP）流式細(xì)胞儀檢測(cè) 用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化收集上述對(duì)照組及不同加熱時(shí)間處理組細(xì)胞(約5×105），PBS洗2遍，1500rpm、4℃、5min收集細(xì)胞，棄上清，加入500μl的Bingding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5μl Annexin-V-EGFP及5μlPI混勻后，室溫避光反應(yīng)15min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞膜PS外翻的情況， 用Muticycle軟件分析計(jì)算凋亡心肌細(xì)胞的百分比。結(jié)果判定:Annexin V-/PI-為正常細(xì)胞，AnnexinⅤ+/PI-為凋亡細(xì)胞，Annexin V+/PI+為壞死細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均數(shù)。

2 結(jié)果

膜聯(lián)蛋白(Annexin-Ⅴ-EGFP）流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組HepG2細(xì)胞的凋亡情況:Annexin-Ⅴ是一種細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸(PS）親和蛋白，經(jīng)EGFP熒光標(biāo)記后的熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞膜的PS密度，進(jìn)而反映細(xì)胞凋亡率。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)照組HepG2細(xì)胞凋亡率僅為13.23，加溫處理組細(xì)胞凋亡率為20.07、25.52、32.83，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡率明顯增加(P＜0.01），隨著加熱時(shí)間的延長，細(xì)胞凋亡率增加。提示加熱可誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡，且凋亡情況與加熱時(shí)間有關(guān)見附表。

附表 不同加熱時(shí)間對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響(±S）

附表 不同加熱時(shí)間對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響(±S）

與對(duì)照組比較:▲P＜0.01

組別 n 細(xì)胞凋亡率(%）對(duì)照組 8 13.23±1.89加熱0.5h組 8 20.07±4.50▲加熱1.0h組 8 25.52±2.70▲加熱1.5h組 8 32.83±4.93▲

3 討論

腫瘤熱療已成為繼手術(shù)、放療、化療之后的一種全新的治療腫瘤的“綠色療法”。腫瘤熱療即利用有關(guān)物理能量在組織中沉淀而產(chǎn)生熱效應(yīng)，使腫瘤組織溫度上升到有效治療溫度，并維持一段時(shí)間以殺死癌細(xì)胞，又不損傷正常細(xì)胞的一種治療方法。熱對(duì)細(xì)胞的殺傷作用是由于熱可以引起蛋白質(zhì)的變性和細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的損害，熱療可以長時(shí)間抑制DNA的合成[3]。體外研究表明，熱療通常存在一個(gè)臨界溫度，在臨界溫度以下熱誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為熱作用的主要機(jī)制，而臨界溫度以上則主要引起細(xì)胞壞死[4]。熱療能增加腫瘤細(xì)胞的血流速度和細(xì)胞代謝，這樣能使更多的化療藥物、放射劑量、基因的靶向治療作用于腫瘤細(xì)胞能更加有效的控制腫瘤[5]。本實(shí)驗(yàn)采用43℃水浴不同的加熱時(shí)間處理細(xì)胞，用Annexin-Ⅴ-EGFP流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組HepG2細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組HepG細(xì)胞凋亡率僅為13.23，加溫處理組細(xì)胞凋亡率為20.0、25.52、32.83。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比:細(xì)胞凋亡率明顯增加(P＜0.01），隨著加熱時(shí)間的延長，細(xì)胞凋亡率增加。提示加熱可誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡，且凋亡情況與加熱時(shí)間有關(guān)。流式細(xì)胞儀是目前定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡的常用方法，常用于檢測(cè)因DNA損傷而引起的細(xì)胞凋亡[6]。本實(shí)驗(yàn)為臨床應(yīng)用熱療治療腫瘤提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但熱療具體通過何種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有待進(jìn)一步研究。

[1]劉連新，周津，王秀琴，等.凋亡相關(guān)基因在肝癌及正常肝組織表達(dá)的概況[J].中華腫瘤雜志，2001，23(4）:273.

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[6]Wagner ED,Anderson D,Dhawan A,et al.Evaluatio of EMS-induced DNA damage in the single cell ge electrophoresis(Comet) assay and with flow cytometri analysis of micronuclei[J].Teratog Carcinog Mutagen 2003,Suppl 2:1-11.