王麗萍，王靖宇，姜長斌

(1.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院，大連 116001;2.大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，大連 116001 3.大連醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)院，大連 116027)

淺析BDNF改善癡呆老齡鼠記憶障礙CA1區(qū)GrayⅠ型突觸結(jié)構(gòu)相關(guān)參數(shù)的變化

王麗萍1，王靖宇2，姜長斌3

(1.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院，大連 116001;2.大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，大連 116001 3.大連醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)院，大連 116027)

目的 探討B(tài)DNF(Brain derived neurotrophic factor)改善癡呆老齡鼠記憶障礙的機(jī)制。方法 利用Morris迷宮試驗(yàn)觀察腦內(nèi)微量注射BDNF對癡呆小鼠自發(fā)活動(dòng)和記憶鞏固過程的影響，應(yīng)用透射電鏡和形態(tài)計(jì)量學(xué)分析癡呆老齡鼠海馬GrayⅠ型突觸的突出結(jié)構(gòu)參數(shù)的變化。結(jié)果 BDNF使癡呆小鼠在新異環(huán)境中的自發(fā)活動(dòng)和探究行為明顯增多;并顯著延長電擊后24 h的步入潛伏期(STL);BDNF使癡呆老齡鼠海馬CA1區(qū)GrayⅠ型突觸的體積密度、面積密度、比表面和面數(shù)密度較治療前增大，突觸平均面積增大;突出界面曲率、突出間隙寬度、突出后致密物質(zhì)均較治療前增大，而較正常對照組減小。結(jié)論 突觸結(jié)構(gòu)的變化和突出數(shù)量的減少是癡呆發(fā)病的病理機(jī)制之一;BDNF能夠促進(jìn)突觸重建，改善癡呆老齡鼠的學(xué)習(xí)記憶。

老年性癡呆;腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子;海馬 ;突觸

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子是神經(jīng)生長因子家族中的一員;是神經(jīng)生長和功能活動(dòng)必須的多肽類因子，存在于神經(jīng)系統(tǒng)，且能夠在腦內(nèi)選擇性作用于前腦膽堿能神經(jīng)元。它對老年性癡呆(Alzheimer's disease)的防治作用受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。我們以往的實(shí)驗(yàn)證明［1］，NGF可以改善癡呆老齡鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，考慮到學(xué)習(xí)記憶與神經(jīng)元突觸改變有關(guān)，本工作進(jìn)一部觀察了BDNF改善癡呆老齡鼠記憶障礙同時(shí)，探討相關(guān)區(qū)域神經(jīng)突觸的變化。對揭示BDNF在癡呆治療的相關(guān)形態(tài)學(xué)變化中的作用具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象

本工作選用18月齡90只(SPF)級 ICR小鼠，在大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)［生產(chǎn)許可證號:SCXK(遼)2008－0002使用許可證號:SYXK(遼)2008－0002］。體重48±3.5 g。室溫，自由進(jìn)食飲水，12 h晝夜。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

以Morris水迷宮試驗(yàn)測試小鼠空間學(xué)習(xí)記憶，證實(shí)存在智能障礙，并分為用藥組和對照組。

1.3 腦內(nèi)微量注射

按文獻(xiàn)［2］報(bào)道方法進(jìn)行定位 ，以微量泵進(jìn)行海馬內(nèi)注射。

1.4 電鏡樣品制備

取治療組、對照組和正常組各20只，用脊髓離斷法將小鼠處死，使腦組織充分固定取腦。行常規(guī)電鏡包埋與軸鉛雙染色，每份標(biāo)本觀察3張銅網(wǎng)，每張銅網(wǎng)由左上向右下移動(dòng)，并隨機(jī)拍攝5張10000倍顯微照片，在經(jīng)光學(xué)放大至30000倍。

1.5 形態(tài)計(jì)量方法

在放大30000倍條件下，按鄭富盛方格點(diǎn)陣計(jì)數(shù)及截距法［2］和龔云等［3］方法對 GrayⅠ型突觸的體積密度(Vv)、面積密度(Sv)、比表面(δ)平均面積(ā)面數(shù)密度(NA)，突觸界面曲率、突觸間隙寬度及突觸后致密物厚度等結(jié)構(gòu)參數(shù)進(jìn)行計(jì)量分析，用 SPSS軟件包統(tǒng)計(jì)，求得平均值，標(biāo)準(zhǔn)差，行 t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 逃避潛伏期比較

行為空間記憶兩組癡呆老齡鼠用藥后自發(fā)運(yùn)動(dòng)減少，食欲不振，對外界刺激反應(yīng)遲鈍。治療組術(shù)后48 h死亡3只，對照組術(shù)后48 h內(nèi)死亡2只，治療前各組潛伏期延長。治療后對照組無明顯改變。BDNF組治療后潛伏期縮短。表1結(jié)果顯示治療組及對照組與正常組比較小鼠均存在空間記憶障礙(P ＜0.01)，海馬注入 BDNF后，行為空間記憶狀況好轉(zhuǎn)。與對照組及治療前比較相應(yīng)指標(biāo)有明顯變化(P ＜0.01)。

表1 Morris水迷宮檢測癡呆老齡鼠平均逃避潛伏期比較Tab.1 Result of average escape latency(s)in each group of Morris labyrinth test

2.2 癡呆老齡鼠相關(guān)突觸參數(shù)變化

癡呆老齡鼠海馬CA1區(qū)Gray通過表2我們可以看出，突觸的體積密度(Vv)、面積密度(Sv)、比表面(δ)面數(shù)密度(NA)較對照均減小，平均面積(ā)較對照組增大。表2結(jié)果說明癡呆老齡鼠相關(guān)突觸參數(shù)，在治療前與正常組比較明顯降低(P＜0.01)，既突觸丟失。而GrayⅠ型突觸平均面積ā增大，可能癥狀改善的主要原因。

表2 海馬CA1區(qū)GrayⅠ型突觸結(jié)構(gòu)參數(shù)Tab.2 Intrahippocampal CA1 area GrayⅠ

2.3 突觸結(jié)構(gòu)相關(guān)參數(shù)的變化

癡呆老齡鼠海馬CA1區(qū)GrayⅠ型突觸結(jié)構(gòu)相關(guān)參數(shù);治療后突觸界面曲率無明顯變化，突觸間隙變窄，突觸后膜致密物質(zhì)增加(表3)。學(xué)習(xí)記憶減退時(shí)突觸間隙增大［6］本實(shí)驗(yàn)在癡呆老齡鼠海馬CA1區(qū)GrayⅠ型突觸的突觸間隙變寬(圖1)，治療后突觸數(shù)量增加同時(shí)突觸間隙變窄(P＜0.01)(圖2)(圖1～2見彩插5)。

表3 小鼠海馬CA1區(qū)突觸結(jié)構(gòu)參數(shù)的變化Tab.3 Changes of structural parameter of synaptic interface in CA1 in rat

3 討論

BDNF對周圍和中樞神經(jīng)元有廣泛的作用［4］。BDNF通過與突觸后膜受體結(jié)合能促進(jìn)背根節(jié)、三叉神經(jīng)節(jié)、節(jié)狀節(jié)、三叉神經(jīng)中腦核等感覺神經(jīng)元的存活和突起的生長。BDNF通過不同的途徑分別促進(jìn)不同的基因表達(dá)或蛋白合成，發(fā)揮著不同的作用［5］。BDNF主要促經(jīng)胞體的發(fā)育與相關(guān)報(bào)道一致［6］。因此，BDNF對神經(jīng)元損傷修復(fù)與再生起重要作用，具有廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值.BDNF被認(rèn)為是一種由感覺神經(jīng)元釋放的順行性營養(yǎng)信息因子來影響NGF和調(diào)節(jié)感受傷害信息的反應(yīng).它可能具有改善智能的作用［7］。外源性 BDNF可以減少脊髓內(nèi)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的死亡［8］。BDNF有可能通過其受體而發(fā)揮存活與再生效應(yīng)。

學(xué)習(xí)記憶功能減退是腦老化的一個(gè)重要表現(xiàn)，BDNF與中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸的結(jié)構(gòu)和功能的可塑性密切相關(guān)［2］。衰老時(shí)突觸數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)異常及長時(shí)程突觸后電位增強(qiáng)(LTP)的快速衰減，在Alzheimer病患者某些腦區(qū)也發(fā)生突出數(shù)量減少等改變［7］。突觸是神經(jīng)元之間結(jié)構(gòu)和功能的接觸點(diǎn)，它的結(jié)構(gòu)和功能的完整對于保證神經(jīng)元獲得信息傳遞、加工和貯存的順利進(jìn)行是非常重要的。突觸丟失是癡呆學(xué)習(xí)記憶減退的神經(jīng)機(jī)制之一。突觸平均面積增大，一方面殘留的突觸細(xì)胞通過增加自身面積(平均增加40.20%)增加其與受體結(jié)合的功能，另一方面胞體增加導(dǎo)致其表面積增加，最終學(xué)習(xí)記憶狀況得以改善。與正常組比較BDNF組相關(guān)突觸結(jié)構(gòu)參數(shù)無明顯差異性(P＜0.05)說明海馬GrayⅠ區(qū)突觸結(jié)構(gòu)明顯改變，從而只能得以改善，BDNF治療癡呆可能會(huì)達(dá)到治本的目的。

本試驗(yàn)提示癡呆老齡鼠海馬突觸面數(shù)密度、面積密度和體密度下降(P＜0.01)與衰老和Alzheimer病腦組織突觸的結(jié)構(gòu)參數(shù)變化結(jié)果是一致的。突觸界面曲率是突觸結(jié)構(gòu)可塑性的一個(gè)重要參數(shù)，較大的突觸曲率可擴(kuò)大接觸面，保證其釋放的遞質(zhì)到達(dá)靶部位，減少向周圍間隙擴(kuò)散，提高突觸傳遞效應(yīng)［8］。癡呆老齡鼠突觸界面曲率減小，減少了神經(jīng)元的接觸面，大大降低了神經(jīng)信息傳遞的有效性，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降。而治療后，曲率變化明顯(P＜0.05)胞體增大。受體增加，癥狀改善。

突觸后膜致密物質(zhì)衰老使海馬CA1突觸后膜致密物厚度減小，提示突觸后膜上受體與離子通道等發(fā)生變化，從而在功能上影響突觸傳遞的效率，學(xué)習(xí)記憶能力減退。BDNF治療癡呆的作用機(jī)制可能與其增加突觸結(jié)構(gòu)及相應(yīng)參數(shù)有關(guān)，而治療后與正常組比較無顯著差異性說明BDNF對癡呆的治療有效。

我們以往的研究表明，BDNF可以使皮層、海馬區(qū)域酶活性恢復(fù)［9］。結(jié)合本次試驗(yàn)結(jié)果，是否可以推測BDNF可以改善突觸結(jié)構(gòu)，使相應(yīng)受體與NGF結(jié)合，從而發(fā)揮生物學(xué)作用。另外，本次試驗(yàn)還提示GrayⅠ型突觸內(nèi)部分子結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，因此對于進(jìn)一步在分子水平探討老年癡呆學(xué)習(xí)記憶障礙的神經(jīng)病理機(jī)制有重要意義。

［1］邱澤文，王麗萍，姜春玲，等.外源性NGF對癡呆老齡鼠P物質(zhì)與 ChAT－IR表達(dá)的影響［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2006，16(12):720－722.

［2］鄭富盛.細(xì)胞形態(tài)立體計(jì)量學(xué)［M］.北京:北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1990:16.

［3］龔云，馮慎遠(yuǎn).鋅對大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及其與海馬CA3區(qū)和大腦皮質(zhì)感覺運(yùn)動(dòng)區(qū)突觸界面結(jié)構(gòu)的相關(guān)性研究［J］.解剖學(xué)雜志，2000，23(1):441.

［4］James RT，Rory C，Vivien W，et al.Axotomy upregulates the anterograde transport and expression of brain－derived neurotrophic factor by sensory neurons［J］Neurosci，1998，18(11):4374－4383

［5］Hyman RA，Hofer M，Barde YA，et al.BDNF is a neurotrophic factor for dopamintergic neurons of substantia nigra［J］.Nature，1991，350:230.

［6］劉麗敏，黃海霞.BDNF和NT－3對胚胎大鼠脊髓神經(jīng)元生長發(fā)育的影響［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，23(3):201－205.

［7］Geinisman Y.Structural synaptic modifications associated with hippocampal LTP and behavioral learning［J］.Cerebral Cortex，2000，10(10):952－962

［8］Martone ME，Hu BR，Ellisman MH.Altcrations of hippocampal postsynaptic densitics following transient ischemia［J］.Hippocampus，2000，10(5):610.

［9］王麗萍，王海霞，姜長斌，等.腦源性神經(jīng)生長因子對老齡鼠智能影響的探討［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2007，8:481.

Analyses of the Effects of BDNF on Memory Ability in Dementia Senile Mice’s GrayⅠof CA1 Area

WANG Li－ping1，WANG Jing－yu2，JIANG Chang－bin3
(1.Affiliated Zhong－shan Hospital of the Dalian University，Dalian 116001，China;2.Laboratory Animal Center of the Dalian Medical University，Dalian 116027，China;3.The Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116027，China)

Objective To explore the mechanism of the BDNF on senile dementia mice.Method The senile dementia mice were tested by Morris water maze.The changes of the hippocampus synaptic structural parameters and Gray typeⅠwere studied with transmission electron microscope and morph metric analysis.Result The spontaneous activity and exploratory behavior in the new and abnormal environment were obviously increased.The step－through latency(STL)was prolonged significantly after electrical stimulation.After treatment by BDNF the volume density on area of Gray typeⅠsynapses in CA1 sector of hippocampus were increased significantly，the parameters were decreased compared with the normal mice.Especially，the curvature of synaptic interface，the width of synaptic cleft and the thickness of postsynaptic density were increased compared with the control group，while the parameters were decreased compared with the normal mice.Conclusion The change of the synaptic structure and decrease in the synaptic number is one of the reasons on dementia pathological mechanism.BDNF can promote synaptic reconstruction and improve the memory of senile dementia mice.

Alzheimer’s disease;Brain derived neurotrophic factor(BDNF);Hippocampus;Synaptic

R－33

A

1671－7856(2010)06－0026－03

2010－03－05

圖1 對照組癡呆老齡鼠GrayⅠ型突觸間隙變寬 (電鏡×15000×2)
Fig.1 Synaptic active zone(nm)Was broaden in GrayⅠ (Electric microscope×15000×2)

圖2 治療后突觸數(shù)量增加同時(shí)突觸間隙變窄 (電鏡×15000×2)
Fig.2 Synaptic active zone(nm)Was narroW doWn and synaptic increased in GrayⅠ(Electric microscope×15000×2)

遼寧省科技計(jì)劃項(xiàng)目(20054080020大連市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2005E11SF006)。

王麗萍(1968－)，碩士，神經(jīng)內(nèi)科副教授，副主任醫(yī)師。