汪何雅，于汐洋，錢(qián) 和*，姚衛(wèi)蓉

肉味香基中的抗氧化物質(zhì)的分離及抗氧化活性

汪何雅，于汐洋，錢(qián) 和*，姚衛(wèi)蓉

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

目的：對(duì)肉味香基中具有抗氧化活性的成分進(jìn)行分離，探討其結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系。方法：利用膜分離和色譜分離手段對(duì)肉味香基中抗氧化成分進(jìn)行分離，考察各組分對(duì)AAPH和Fe3+/VC誘導(dǎo)的卵磷脂脂質(zhì)體氧化以及脂質(zhì)體自動(dòng)氧化的抑制效果。結(jié)果：根據(jù)分子質(zhì)量將肉味香基分離得到3個(gè)分子質(zhì)量段的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(MRPs)，其中高分子質(zhì)量MRPs(H-MRPs)抗氧化活性最強(qiáng)；H-MRPs進(jìn)一步分離得到H-MA、H-MB、H-MC 3類(lèi)組分，極性由弱到強(qiáng)為：H-MA＜H-MB＜H-MC，抗氧化能力從高到低為：H-MA＞H-MB＞H-MC。結(jié)論：肉味香基中主要發(fā)揮抗氧化作用的組分是高分子質(zhì)量MRPs，并且其極性越弱，抗氧化能力越強(qiáng)。

肉味香基；抗氧化；美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(MRPs)；卵磷脂脂質(zhì)體(LPS)

通過(guò)氨基酸或植物蛋白水解物與還原糖高溫加熱發(fā)生美拉德反應(yīng)(Maillard reaction)，制備得到的反應(yīng)型肉味香基，其香味逼真，成本低廉，是開(kāi)發(fā)咸味香精必不可少的配料，主要用于方便面調(diào)料、雞精、罐頭、熏肉、醬肉、香腸、火腿腸、香辣醬等食品以及動(dòng)物飼料和寵物食品[1]，以增加或賦予食品肉風(fēng)味，滿(mǎn)足人們對(duì)肉風(fēng)味的需要。美拉德反應(yīng)是在食品加工和儲(chǔ)存過(guò)程中氨基酸或蛋白質(zhì)和碳水化合物發(fā)生的一系列復(fù)雜反應(yīng)，它是食品烹調(diào)和加工過(guò)程中產(chǎn)生食品風(fēng)味和食品色澤的重要途徑。許多研究表明氨基酸-還原糖、面包皮/咖啡提取物或熱處理的膳食中的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(Maillard reaction products，MRPs)具有抗氧化功能[2-5]。MRPs的抗氧化功能主要來(lái)源于有色物類(lèi)黑精、還原酮及一系列含N、S的雜環(huán)化合物，其中的某些物質(zhì)的抗氧化能力能達(dá)到常用抗氧化劑同樣的水平，如在高脂類(lèi)食品中加入MRPs產(chǎn)物能抑制脂類(lèi)氧化[6]。近年來(lái)，針對(duì)氨基酸-還原糖高溫反應(yīng)產(chǎn)物、面包皮提取物、咖啡提取物以及高溫加熱膳食中存在的MRPs的抗氧化性已有大量研究，但對(duì)于咸味香精中MRPs的抗氧化功能還未見(jiàn)報(bào)道。本研究以咸味香精調(diào)配前的肉味香基為對(duì)象，利用膜過(guò)濾和色譜分離手段對(duì)肉味香基中抗氧化成分進(jìn)行分離，探討肉味香基中抗氧化成分的結(jié)構(gòu)和活性之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉味香基 國(guó)內(nèi)某香精公司；MWCO 8000～14000透析袋、GF254薄層硅膠板、硅膠(100～200目) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MWCO 1000超濾膜片 無(wú)錫賽普膜科技有限公司。

大豆卵磷脂(純度98%)、2,2 -鹽酸脒基丙烷(AAPH，純度98%) Sigma公司；硫代巴比妥酸(TBA)、三氯乙酸(TCA)、抗壞血酸(VC)均為化學(xué)純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UF201超濾設(shè)備 無(wú)錫賽普膜科技有限公司；R-501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申順生物科技有限公司；YD-900L超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 上海之信儀器有限公司；THZ-82恒溫水浴振蕩器 常州國(guó)華電器有限公司；WFJ7200可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.3 肉味香基中抗氧化成分的初步分離

稱(chēng)取肉味香基，稀釋、抽濾得澄清液體。4℃去離子水透析，直到透出液呈無(wú)色透明，未透出液記為H-MRPs(＞14kD)，冷凍干燥備用。濃縮透出液，利用截留分子質(zhì)量1kD的超濾膜進(jìn)行超濾分離(使用壓力0.5MPa)，收集滯留液及濾液，分別記為M-MRPs(1～14kD)、L-MRPs(＜1kD)，冷凍干燥備用。

1.4 硅膠柱層析分離純化H-MRPs

稱(chēng)量100～200目硅膠100g，加入一定量的95%乙醇充分?jǐn)嚢璩蓜驖{。將硅膠邊攪拌邊緩緩倒入層析柱(25mm×200mm)中，待硅膠沉積后，再加入95%乙醇使床層壓實(shí)。稱(chēng)取一定量的H-MRPs，配成質(zhì)量濃度為10mg/mL的溶液，濕法上樣2～3mL。用洗脫劑進(jìn)行洗脫，洗脫速度為0.5mL/min，每5min收集一管洗脫液，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于420nm波長(zhǎng)處檢測(cè)MRPs含量，收集洗脫液進(jìn)行冷凍干燥

1.5 各組分對(duì)卵磷脂脂質(zhì)體氧化水平的影響

1.5.1 大豆卵磷脂脂質(zhì)體(LPS)的制備

參照文獻(xiàn)[7]并稍加改進(jìn)。大豆卵磷脂溶解于石油醚中，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(3500r/min，水浴35℃)和氮?dú)馊コ袡C(jī)溶劑，得到均勻分散的卵磷脂薄膜，加入10mmol/L磷酸緩沖液(pH7.4)，超聲波處理15min，得到白色、乳狀的脂質(zhì)體溶液LPS，LPS終質(zhì)量濃度為10mg/mL。

1.5.2 各組分對(duì)卵磷脂脂質(zhì)體氧化水平的影響

1.5.2.1 AAPH誘導(dǎo)氧化

在試管中加入LPS和不同質(zhì)量濃度的樣品，其中LPS終質(zhì)量濃度10mg/mL，然后加AAPH(終質(zhì)量濃度10mg/mL)。加樣完畢后避光于37℃水浴孵育1h，冷卻，用TBA法[8]測(cè)定脂質(zhì)過(guò)氧化程度。測(cè)定步驟如下：

反應(yīng)體系中加入2mL TCA-TBA-HCl(1.68g TCA和41.6mg TBA溶解于10mL 0.125mol/L HCl溶液中)，混合液于沸水浴加熱15min，迅速冷卻，5500r/min離心20min，取上清液于532nm波長(zhǎng)處測(cè)定得到吸光度As，以重蒸水代替樣品做為空白對(duì)照，測(cè)得吸光度 Ac。按下式計(jì)算樣品對(duì)脂質(zhì)體過(guò)氧化的抑制率。

1.5.2.2 Fe3+/VC誘導(dǎo)氧化[9]

試管中依次加入1mL LPS、1mL 400μmol/L FeCl3、1mL 400μmol/L VC和1mL樣品，混勻。避光并于37℃水浴加熱60min，冷卻。脂質(zhì)過(guò)氧化程度的測(cè)定方法同1.5.2.1節(jié)。

1.5.2.3 自動(dòng)氧化

試管中加入LPS，避光并于37℃水浴加熱24h，冷卻。脂質(zhì)過(guò)氧化程度的測(cè)定方法同1.5.2.1節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分子質(zhì)量MRPs的抗氧化活性

表1 肉味香基以及不同分子質(zhì)量的MRPs對(duì)3種脂質(zhì)過(guò)氧化體系的抑制率Table 1 Inhibitory effects of the meat flavor studied and its ultrafiltration fractions on the induced oxidation and autooxidation of soybean phosphatidylcholine liposomes %

本研究所選擇的肉味香基是通過(guò)植物蛋白水解物與還原糖高溫加熱制備得到的，是直接的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。由表1可見(jiàn)，在3種脂質(zhì)體氧化模型中，肉味香基都具有一定的抗氧化性；分離得到的3種分子質(zhì)量范圍的MRPs中，高分子質(zhì)量的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(H-MRPs)發(fā)揮較高的抗氧化活性。早在1953年，Hodge等[10]首先報(bào)道了有關(guān)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有防止植物油氧化的效果。Franzke等[11]在1954年也發(fā)現(xiàn)，人造奶油中添加甘氨酸-葡萄糖反應(yīng)產(chǎn)物后可以提高人造奶油的氧化穩(wěn)定性。目前許多研究表明氨基酸-還原糖模擬體系的反應(yīng)產(chǎn)物、面包皮/咖啡提取物或熱處理的膳食中的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有抗氧化功能[2-5]。另有研究發(fā)現(xiàn)MRPs還具有很強(qiáng)的消除活性氧的能力[12]。近年來(lái)大量研究結(jié)果顯示，MRPs中起主要抗氧化、消除活性氧等作用的物質(zhì)是一類(lèi)高分子質(zhì)量的食品類(lèi)黑精[13-15]，Yoshimura等[16]初步研究葡萄糖-甘氨酸的反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化能力時(shí)發(fā)現(xiàn)，一部分類(lèi)黑精抗氧化能力甚至超過(guò)BHA和沒(méi)食子酸丙醋等。這些研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

2.2 硅膠柱層析法對(duì)H-MRPs進(jìn)行分離純化

2.2.1 流動(dòng)相的確定

結(jié)合文獻(xiàn)，根據(jù)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的性質(zhì)，選定以下幾組流動(dòng)相：正己烷-乙酸乙酯、甲醇-乙酸乙酯、甲苯-乙酸乙酯、正丁醇-水、乙醇-水，考察它們?cè)赥LC板上對(duì)H-MRPs的分離情況，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各流動(dòng)相體系的薄層色譜圖Fig.1 Thin layer chromatographic profiles of the high-molecular weight fraction using different mobile phases

由圖1可知，只有正丁醇-水和乙醇-水體系能達(dá)到較佳的分離效果；而且，后者的Rf值為0.756，分離效果更好。因此，確定95%乙醇-水作為流動(dòng)相來(lái)分離H-MRPs。

2.2.2 乙醇-水作為流動(dòng)相分離H-MRPs

圖2 不同的乙醇-水洗脫配比對(duì)產(chǎn)品洗脫特性的影響Fig.2 Effect of different ethanol concentration gradients on further fractionation of the high-molecular weight fraction

由圖2可知，H-MRPs經(jīng)硅膠柱分離得到3個(gè)組分，按洗脫得到的先后順序分別為H-MA、H-MB、H-MC。當(dāng)起始洗脫劑為95%乙醇時(shí)，H-MA組分和H-MB組分得到了較好的分離；然后，加大洗脫劑的極性，進(jìn)一步洗脫出組分H-MC(圖2c)。因此，選用95%乙醇-水洗脫體系對(duì)H-MRPs進(jìn)行梯度洗脫，收集得到H-MA、H-MB、H-MC 3種組分，3種組分質(zhì)量比為3.2:1:2.3。硅膠柱層析是根據(jù)極性不同來(lái)分離H-MRPs，由于乙醇極性小于水的極性，因此分離得到的3個(gè)組分極性由大到小為：H-MC＞H-MB ＞H-MA。2.3各組分對(duì)卵磷脂脂質(zhì)體氧化水平的影響

圖3 H-MRPs各組分對(duì)AAPH誘導(dǎo)的脂質(zhì)體過(guò)氧化的抑制作用Fig.3 Inhibitory effects of the high-molecular weight fraction and its three subtractions on AAPH induced oxidation of soybean phosphatidylcholine liposomes

圖4 H-MRPs各組分對(duì)Fe3+/VC誘導(dǎo)的脂質(zhì)體過(guò)氧化的抑制作用Fig.4 Inhibitory effects of the high-molecular weight fraction and its three subtractions on Fe3+/VC induced oxidation of soybean phosphatidylcholine liposomes

圖5 各組分對(duì)脂質(zhì)體自動(dòng)氧化的抑制作用Fig.5 Inhibitory effects of the high-molecular weight fraction and its three subtractions on autooxidation of soybean phosphatidylcholine liposomes

由圖3～5可見(jiàn)，在3種脂質(zhì)體氧化模型中，H-MA、H-MB和H-MC組分均具有抗氧化效果，并且它們的抗氧化活性由大到小均為：H-MA＞H-MB＞H-MC。當(dāng)反應(yīng)物起始質(zhì)量濃度為5mg/mL時(shí)，H-MA、H-MB和H-MC組分對(duì)AAPH誘導(dǎo)的脂質(zhì)體氧化的抑制率分別為76.07%、72.68%和70.36%；當(dāng)反應(yīng)物起始質(zhì)量濃度增加至10mg/mL時(shí)，H-MA、H-MB和H-MC組分的抑制率分別增大至98.95%、89.57%和75.12%。并且，在3種脂質(zhì)體氧化模型中，H-MA組分的抗氧化效果均顯著高于H-MRPs(P＜0.05)。因此，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，在H-MRPs中，極性較小的組分具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

類(lèi)黑精廣泛分布于人們的日常飲食之中，現(xiàn)在已經(jīng)有學(xué)者嘗試從食品(如咖啡、黑啤酒和豆醬)中分離和純化類(lèi)黑精，然而由于食品中類(lèi)黑精組成的復(fù)雜性以及大量衍生化合物的生成，即使是最先進(jìn)的分離手段和檢測(cè)手段也不能完全確定所有類(lèi)黑精的特性。本研究顯示MRPs的極性越弱，抗氧化能力越強(qiáng)，該結(jié)果與秦禮康等[17]的研究結(jié)果一致。秦禮康等將陳窖豆豉類(lèi)黑精按極性分離成不同組分，并對(duì)各組分的抗氧化效果進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用大孔樹(shù)脂S-8分離類(lèi)黑精得到的無(wú)水乙醇洗脫組分，其抗亞油酸氧化能力最強(qiáng)，超過(guò)了類(lèi)黑精粗提物。

3 結(jié) 論

肉味香基具有較強(qiáng)的抗氧化活性，其中主要發(fā)揮抗氧化作用的組分是高分子質(zhì)量的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(H-MRPs)。根據(jù)極性對(duì)H-MRPs進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，得到極性由弱到強(qiáng)的3個(gè)組分：H-MA、H-MB和H-MC。3個(gè)組分均具有明顯的抗氧化效果，并且其對(duì)卵磷脂脂質(zhì)體氧化的抑制能力隨著其極性的增強(qiáng)而減弱。

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Separation of Antioxidant Components from Meat Flavor and Their Antioxidant Capacities

WANG He-ya， YU Xi-yang， QIAN He*，YAO Wei-rong
(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

The antioxidant components in a commercial meat flavor prepared by Maillard reaction were separated by ultrafiltration and silica column chromatographic fractionation and their antioxidant capacities were investigated by measuring their inhibitory effects on the oxidation induced by AAPH or Fe3+/VC and autooxidation of soybean phosphatidylcholine liposomes. The meat flavor was fractionized into three fractions with molecular weights separately varying in three ranges. Among them, the high-molecular weight fraction had the strongest antioxidant activity, and it was further separated into three subfractions, H-MA, H-MB and H-MC and their order of polarity was H-MA ＜ H-MB ＜ H-MC and their order of antioxidant activity was H-MA ＜ H-MB ＜ H-MC. As a conclusion, the major component in the meat flavor responsible for antioxidant activity is the high-molecular weight fraction and the weaker polarity, the stronger antioxidant activity.

meat flavor；antioxidant；Maillard reaction products (MRPs)；liposome (LPS)

TS202.3

A

1002-6630(2010)19-0059-04

2010-01-14

汪何雅(1980—)，女，講師，博士，研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)與食品安全。E-mail：heyawang@163.com *通信作者：錢(qián)和(1963—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail：amtf168@126.com