方邦江 周 爽 陳寶瑾 黃金陽 耿 赟 季學(xué)清 郭 全 王 宏上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院（200032）

復(fù)元醒腦湯對高血壓性腦出血大鼠血-腦屏障通透性的干預(yù)作用

方邦江 周 爽 陳寶瑾 黃金陽 耿 赟 季學(xué)清 郭 全 王 宏
上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院（200032）

目的 探討復(fù)元醒腦湯對高血壓性腦出血大鼠腦水腫及血-腦屏障通透性的干預(yù)作用。方法 將SHR大鼠隨機分為四組，分別為假手術(shù)組、模型組、安宮牛黃膠囊組、復(fù)元醒腦湯組，并與WKY大鼠假手術(shù)組對照,每組20只大鼠。模型組、安宮牛黃膠囊組和復(fù)元醒腦湯組在收縮壓達到21.3KPa基礎(chǔ)上以膠原酶加肝素尾狀核注射法誘發(fā)腦出血，建立高血壓性腦出血模型，其中安宮牛黃膠囊組和復(fù)元醒腦湯組分別給予相應(yīng)藥物干預(yù)，于造模后連續(xù)灌胃3天。兩假手術(shù)組腦內(nèi)注射及灌胃均為生理鹽水，模型組灌胃為生理鹽水。觀測各組動物神經(jīng)缺損行為體征、腦組織含水量、血-腦屏障通透性變化。結(jié)果 SHR模型組與WKY假手術(shù)組、SHR假手術(shù)組比較，神經(jīng)缺損行為體征評分升高（均P＜0.01），腦組織含水量增加（均P＜0.01），腦組織中伊文思藍含量亦增加（均P＜0.01）；SHR復(fù)元醒腦湯和SHR安宮牛黃膠囊兩治療組分別與SHR模型組比較，神經(jīng)缺損行為體征評分降低（均P＜0.01），腦組織含水量減少（均P＜0.01），腦組織中伊文思藍含量亦降低（均P＜0.01）；上述指標變化復(fù)元醒腦湯組與安宮牛黃膠囊組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。結(jié)論 復(fù)元醒腦湯可降低血-腦屏障通透性，減輕腦水腫程度，改善神經(jīng)功能缺損，達到治療高血壓性腦出血的目的。

腦出血；腦水腫；自發(fā)性高血壓大鼠；血-腦屏障

腦出血（Cerebral Hemorrhage，CH）是指原發(fā)性腦實質(zhì)的非創(chuàng)傷性出血，是臨床常見的腦血管疾病，主要病因是高血壓。高血壓伴發(fā)腦內(nèi)小動脈病變，當血壓驟升時破裂出血，稱為高血壓性腦出血。腦出血后引起機體和腦組織局部發(fā)生系列病理生理學(xué)反應(yīng)，在血腫周圍腦組織形成水腫帶，繼而引起神經(jīng)細胞及其軸突的變性和壞死。腦出血后腦水腫的預(yù)防和治療為臨床實踐中重要一環(huán)，在降低患者死亡率和致殘率、改善患者生活質(zhì)量方面起重要作用。臨床應(yīng)用復(fù)元醒腦湯治療腦出血取得顯著臨床效果，為了進一步探討復(fù)元醒腦湯治療腦出血的作用機理，本實驗擬在建立高血壓性腦出血大鼠模型基礎(chǔ)上，觀測復(fù)元醒腦湯對其神經(jīng)功能缺損、腦組織含水量、血-腦屏障(Blood-brain Barrier,BBB)通透性的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SHR大鼠80只，雄性，體重（320±20）g；SPF級京都Wista（Wistar Kyoto，WKY）大鼠20只，雄性，體重（320±20）g。由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，動物合格證：SCXK(滬)2007-005，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院科技樓實驗動物中心。

1.2 主要試劑和儀器 膠原酶Ⅶ、伊文思、藍甲酰胺（Sigma-Aldrich Inc，USA)；肝素（常州千紅生化制藥股份有限公司)；RBP-1型大鼠尾壓心率測定儀（北京中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所）；ZH-藍星B型腦立體定位儀（淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）；微量進樣器（上海安亭微量進樣器廠）；FA2004B電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；恒宇電熱恒溫鼓風干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）；電熱恒溫水箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）；紫外可見分光光度計[UNICO(上海)儀器有限公司]。

1.3 實驗藥物 復(fù)元醒腦湯（人參9g單煎、三七15g，膽南星15g，大黃9g后下等），由本院制劑室生產(chǎn)提供，濃度為1200g生藥／L；安宮牛黃膠囊由河北安國藥業(yè)集團有限公司生產(chǎn)，0.4g/粒，批號：066401。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組 購得動物后，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，運用大鼠心率血壓計測定大鼠尾動脈收縮壓，SHR大鼠血壓達到21.3KPa以上后，統(tǒng)一稱重，按林氏[1]方法應(yīng)用SPSS11.5軟件包將SHR大鼠隨機分為SHR假手術(shù)組（SHRS）、SHR模型組(SHRM)、SHR安宮牛黃膠囊組（SHRTa）、SHR復(fù)元醒腦湯組（SHRTf）；WKY大鼠為假手術(shù)對照組（WKYS）,每組大鼠20只。

1.4.2 腦出血模型建立 以任氏[2]膠原酶加肝素聯(lián)合尾狀核注射誘導(dǎo)的方法建立腦出血動物模型。造模前1日，各組大鼠禁食。大鼠經(jīng)10%水合氯醛（400mg/kg）腹腔麻醉。頭頂備皮后俯臥位固定于ZH-藍星B型腦立體定位儀上，正中矢狀切開頭皮，剝離骨膜，調(diào)節(jié)門齒托的高度，使動物的前、后囟處于同一水平。頭皮下正中切口約0.8cm，于顱骨背側(cè)前囟后0.2mm、中線旁2.9mm處鉆孔，用固定于立體定位儀上的微量進樣器沿鉆孔進針，深約6mm (此處為尾狀核位置)，注射含有0.5U/μl膠原酶Ⅶ和7U/μl肝素的生理鹽水1μl，緩慢退針，鉆孔處填入明膠海綿，縫合皮膚。WKY假手術(shù)組與SHR假手術(shù)組除注入尾殼核的液體為生理鹽水外，其余步驟同模型組。

1.4.3 藥物干預(yù) SHR復(fù)元醒腦湯組于造模成功后，每日按生藥4.22g/kg體重/d給予復(fù)元醒腦湯灌胃，每日1次，連續(xù)3天；SHR安宮牛黃膠囊對照組于造模成功后，每日按169mg/kg體重/d給予安宮牛黃膠囊灌胃，每日1次，連續(xù)3天。WKY假手術(shù)組、SHR假手術(shù)組、SHR模型組于造模成功后每日灌胃生理鹽水1ml，每日1次，連續(xù)3天。

1.5 檢測項目與方法

1.5.1 血壓測定 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，運用RBP-1型大鼠心率血壓計，在大鼠清醒狀態(tài)下經(jīng)尾動脈測定收縮壓，每只大鼠測3次，取平均值。

1.5.2 神經(jīng)缺損行為體征觀察 造模后3天，各組大鼠采用Bederson[3]神經(jīng)體缺損行為體征評分法進行評分。

輕抓鼠尾，提起高于地面1m，正常大鼠前爪伸直。

0 級（0 分）：無神經(jīng)功能缺損

I級（1 分）：血腫對側(cè)前肢回收屈曲于腹下，同側(cè)前肢向地面伸展

II級（2 分）：I級體征+俯臥于桌面時從血腫側(cè)向?qū)?cè)推大鼠時阻力降低

III級（3 分）：I級體征+II級體征+大鼠行走時向血腫對側(cè)肢體旋轉(zhuǎn)(呈追尾狀)

1.5.3 腦組織含水量測定 腦組織含水量(Brain Water Content,BWC)采用干濕腦重法測定。造模后3天，每組各取6只大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后處死，迅速開顱取腦，取血腫周圍腦組織（WKY假手術(shù)組和SHR假手術(shù)組取相應(yīng)部位腦組織），電子天平先稱取濕重，放入電熱恒溫鼓風干燥箱100℃烘烤24h，再稱取干重，計算腦組織含水量：

1.5.4 伊文思藍含量測定 造模后3天，每組各取6只大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，分離股靜脈，注入2%伊文思藍（Evans Blue，EB，20mg/kg）循環(huán)2h后，迅速開胸暴露心臟，灌注針頭從左心室插至主動脈根部，在右心耳處剪開作為出口，快速灌注生理鹽水總量約250ml，至右心耳流出液體無血色后，迅速開顱取腦。取血腫周圍腦組織（SHR假手術(shù)組和WKY假手術(shù)組取相應(yīng)部位腦組織），稱重后加入3ml甲酰胺，54℃恒溫水浴箱中孵育48h，離心15min，取上清液在紫外分光光度計（λ=632nm）下測定光密度（Optical Density,OD）值。腦組織EB含量以O(shè)D/g濕腦組織表示，用EB含量(OD/g)代表腦血管通透性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，組間均數(shù)比較采用方差分析；等級資料采用Ridit分析[4]。檢驗效能以P＜0.05為差異具有顯著性，P＜0.01為差異具有非常顯著性。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)缺損行為體征評分 由表1可見各組大鼠神經(jīng)缺損行為體征評分情況：SHR假手術(shù)組與WKY假手術(shù)組比較差異無顯著意義（P＞0.05）；SHR模型組、SHR安宮牛黃膠囊組和SHR復(fù)元醒腦湯組與WKY假手術(shù)組、SHR假手術(shù)組比較均具有非常顯著差異（P＜0.01）。SHR安宮牛黃膠囊組、SHR復(fù)元醒腦湯組與SHR模型組比較均具有顯著差異（P＜0.01）；SHR安宮牛黃膠囊組與SHR復(fù)元醒腦湯組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠神經(jīng)缺損行為體征評分

2.2 腦組織含水量 由表2可見，各組大鼠腦組織含水量情況：SHR假手術(shù)組與WKY假手術(shù)組比較差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；SHR模型組、SHR安宮牛黃膠囊組和SHR復(fù)元醒腦湯組與WKY假手術(shù)組、SHR假手術(shù)組比較具有非常顯著差異（P＜0.01）；SHR安宮牛黃膠囊組和SHR復(fù)元醒腦湯組與SHR模型組比較均具有非常顯著差異（P＜0.01）；SHR復(fù)元醒腦湯組與SHR安宮牛黃膠囊組比較無顯著差異（P＞0.05）。

2.3 血-腦屏障通透性 由表2可見各組大鼠伊文思藍含量情況：WKY假手術(shù)組與SHR假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。SHR模型組、SHR安宮牛黃膠囊組和SHR復(fù)元醒腦湯組與WKY假手術(shù)組、SHR假手術(shù)組比較均具有非常顯著差異(P＜0.01)；SHR安宮牛黃膠囊組與SHR模型組比較具有非常顯著性差異(P＜0.01)；SHR復(fù)元醒腦湯組與SHR模型組比較具有顯著性差異(P＜0.05)；SHR復(fù)元醒腦湯組與SHR安宮牛黃膠囊組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 各組大鼠腦組織含水量與伊文思藍含量

表2 各組大鼠腦組織含水量與伊文思藍含量

注：與WKYS比較，▲▲P＜0.01；與SHRS比較，◆◆P＜0.01；與SHRM比較，★★P＜0.01

組別 例數(shù) 腦組織含水量（%） 伊文思藍含量（OD/g）WKYS 6 77.21±0.75 0.3484±0.0998 SHRS 6 77.84±0.53 0.3892±0.0959 SHRM 6 83.07±0.95 ▲▲◆◆ 1.0601±0.3399 ▲▲◆◆SHRTa 6 79.50±0.62 ▲▲◆◆★★ 0.9865±0.3025 ▲▲◆◆★★SHRTf 6 79.31±0.72 ▲▲◆◆★★ 0.8904±0.1678 ▲▲◆◆★

3 討論

腦出血后引起機體和腦組織局部發(fā)生系列病理生理學(xué)反應(yīng)，在血腫周圍腦組織形成水腫帶，繼而引起神經(jīng)細胞及其軸突的變性和壞死。腦水腫可引起顱內(nèi)容物的容積增加，當超過顱腔所能容納的程度時，可引起頭痛、嘔吐、眼底視乳頭水腫、意識障礙、血壓升高及反應(yīng)性脈搏變慢和腦疝形成。此時若不及時采取干預(yù)措施，顱內(nèi)壓繼續(xù)升高，可發(fā)展至腦組織灌注壓降低，致使腦缺氧造成腦組織損害和血管擴張，繼而引起血管運動麻痹，加重腦水腫，引起昏迷及并發(fā)癥，后果嚴重，可導(dǎo)致死亡。

對腦出血后腦水腫研究發(fā)現(xiàn)，血-腦屏障破壞在不同因素引起的腦水腫形成過程中均發(fā)揮重要作用[5]。透射電鏡觀察手術(shù)切除腦出血血腫周圍腦組織發(fā)現(xiàn)[6]，毛細血管內(nèi)皮細胞腫脹，血-腦屏障破壞明顯，小血管內(nèi)外血液成分基本一致，血管外廣泛出血，血管周圍見“空泡樣”變。微血管壁厚薄不一，內(nèi)膜下層不完整，內(nèi)皮細胞間緊密連接受損。進一步研究表明血-腦屏障的損傷與出血時間長短正相關(guān)，與水腫程度正相關(guān)[7]。

腦出血，屬中醫(yī)“中風”的范疇。中醫(yī)學(xué)有關(guān)中風的記載，始見于《內(nèi)經(jīng)》。唐宋以前，諸家皆從內(nèi)虛邪中之說；金元以降，火、虛、痰等論始發(fā)其端；及至明清，內(nèi)傷積損、氣虛血瘀、肝陽化風、血氣上逆等說愈發(fā)豐富。其病因多認為與風、火、痰、虛、瘀密切相關(guān)。我們在長期臨床過程中發(fā)現(xiàn)，中風大多為中老年人，正氣虧虛為中風的基礎(chǔ)?！峨s病源流犀燭·中風源流》云：“人至五六十歲，氣血就衰，乃有中風之病”?！毒霸廊珪し秋L》云：“卒倒多由昏憒，本皆內(nèi)傷積損頹敗而然”。氣虛則痰瘀內(nèi)生，痰、瘀分別是津、血的病理產(chǎn)物，一旦生成，又成為新的病理過程啟動之因。痰是水液代謝障礙形成的病理產(chǎn)物，痰的生成同脾腎功能密切相關(guān)。腎者主水，腎氣不足則水液蒸騰氣化無力，聚而為痰；脾主運化，脾不健運則水濕不化，痰濁內(nèi)生?！皻鉃檠畮洝?，氣虛無力推動血液運行而為瘀血。痰、瘀又可相互促生，膠著為患。痰瘀內(nèi)阻，郁而化熱，熱極生風；或陰血虧虛，水不涵木，肝陽化風，風火相煽，發(fā)為中風。針對中風“正氣虧虛、痰瘀互結(jié)、風火相煽”病機，采取復(fù)元醒腦為主，佐以逐瘀化痰、泄熱息風等促進醒腦開竅之法，自擬復(fù)元醒腦湯治療腦出血取得良好臨床療效。本方人參、三七、大黃、膽南星等藥共用。人參大補元氣，補脾益肺，脾氣健運，肺氣宣暢，則痰濁自消，氣為血帥，氣盛血行，瘀血自消，可達扶正祛邪之目的，為治本之藥；三七止血不留瘀，針對出血性中風止血，并且可以達到化瘀目的；大黃通腑瀉下，清熱解毒，兼具活血化瘀之功，與三七合用一通一澀，止血不留瘀；膽南星清熱化痰，息風定驚。諸藥合用，方小力專，起“復(fù)元醒腦、逐瘀化痰、泄熱熄風”之功。

本實驗結(jié)果證實模型組大鼠神經(jīng)缺損行為顯著惡化，腦組織含水量顯著增加，表明腦出血后腦水腫在病情進行性加重過程中發(fā)揮重要作用，腦水腫程度越重病情越兇險。安宮牛黃丸為臨床治療腦出血急性期常用中成藥，相關(guān)研究表明安宮牛黃丸可以顯著減輕腦出血后腦水腫程度及神經(jīng)缺損行為[8,9]。復(fù)元醒腦湯可以降低高血壓性腦出血大鼠腦組織含水量，進而改善神經(jīng)缺損行為。復(fù)元醒腦湯對高血壓性腦出血的治療作用體現(xiàn)在減輕腦水腫，進而改善神經(jīng)缺損行為，并且其對腦水腫程度及神經(jīng)缺損行為改善具有和安宮牛黃膠囊等同的效果。

高血壓性腦出血大鼠血-腦屏障通透性增加，表明高血壓性腦出血后腦水腫產(chǎn)生與血-腦屏障通透性增加密切相關(guān)，血-腦屏障通透性增加為腦水腫產(chǎn)生的必要中間環(huán)節(jié)，各種因素導(dǎo)致血-腦屏障通透性增加，進而產(chǎn)生腦水腫。復(fù)元醒腦湯可以降低血-腦屏障通透性，表明復(fù)元醒腦湯對腦水腫的治療作用體現(xiàn)在降低血-腦屏障通透性這一有效中間環(huán)節(jié)，減輕腦水腫程度，達到治療高血壓性腦出血的效果。

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The experimental study of Fuyuan Xingnao Decoction on blood-brain barrier permeability in hypertensive cerebral hemorrhage rats

LIN Mei,FANG Bang-Jiang,ZHOU Shuang,CHEN Bao-Jin2,HUANG Jin-Yang,GENG Yun,JI Xue-Qing,GUO Quan,WANG Hong
Department of Chinese Medicine,Central Hospital of Xuhui District,Shanghai 200031,China

Objective To study the effect of Fuyuan Xingnao Decoction on Blood-brain Barrier Permeability in Hypertensive Cerebral Hemorrhage Rats.Methods Spontaneously Hypertensive Rats were randomly divided into four groups,sham operation group(SHRS,N=20), model group(SHRM,N=20),Angong Niuhuang capsule group(SHRTa,N=20),and Fuyuan Xingnao Decoction group(SHRTf,N=20),compared with Wistar Kyoto rats sham operation group(WKYS,N=20).After the systolic pressure stabilizing in 21.3KPa,SHRM,SHRTa and SHRTf were induced cerebral hemorrhage by caudate nucleus injection with collagenase and heparin.Then SHRTa and SHRTf were given corresponding drugs in intragastric administration for three days after getting into cerebral hemorrhage,while SHRS and WKYS were all given intracerebral injection and intragastric administration with physiological saline,and SHRM was given intragastric administration with physiological saline.Rats of all groups were observed respectively their behavior and physical signs of neurologic defect,brain tissue moisture capacity,blood-brain barrier permeability.Results Compared with WKYS group and SHRS group,the SHRM group behavior and physical signs of neurologic defect grades,brain tissue moisture capacity and evans blue(EB) contents all increased up（P＜0.01）；SHRTa group and SHRTf group compared to SHRM group,behavior and physical signs of neurologic defect grades,brain tissue moisture capacity and EB contents all lowered（P＜0.01）；there is no statistical significant difference between SHRTa group and SHRTf group on the index changes（P＞0.05）.Conclusion Fuyuan Xingnao Decoction may achieve the purpose of treating hypertensive cerebral hemorrhage through lowing blood brain barrier permeability,relieve cerebral edema,and improve neurologic impairment.

Cerebral hemorrhage；Cerebral edema；Spontaneously hypertensive rats；Blood-brain barrier

10.3969/j.issn.1672-2779.2010.17.142

1672-2779（2010）-17-0206-03

2010-0）