顧 危頁,龐 智,鄭家駒,沈必武,周春立,皇甫照

(江蘇省蘇州市立醫(yī)院北區(qū)消化內(nèi)科,江蘇蘇州,215008)

CD4+CD25high調(diào)節(jié)性T細胞(CD4+CD25highTr)被認為是一組具有免疫平衡調(diào)節(jié)性功能的T細胞亞群,在維持機體自身免疫耐受過程中具有十分重要作用[1]。已有眾多研究表明,T細胞功能紊亂是炎癥性腸病(IBD)發(fā)病的一個重要因素[2]。雖然已有CD4+CD25highTr在IBD或克羅恩病(CD)或潰瘍性結(jié)腸炎(UC)患者中變化的研究報道[3-6],但國內(nèi)尚未有同時對CD4+CD25high Tr與CT LA-4在CD與UC中的變化進行研究的報道。為此,作者對CD與UC患者同時進行了CD4+CD25highT r的水平和CTLA-4水平進行了初步研究,探討其在IBD中的可能作用與意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象

50例IBD患者(其中UC患者20例,CD患者30例)。均為 2008年 1月～2009年12月在我院門診就診或住院患者,其中男30例,女20例,年齡22～58歲,平均(37±6.3)歲。其診斷均符合2001年我國制定的《對炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的建議》[7]中的診斷標準。IBD組患者近1個月未使用皮質(zhì)激素治療,近3個月未使用過免疫抑制劑。對照組為年齡與性別匹配的體檢健康者29例,年齡26～55歲,平均(38±8.5)歲。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器:CD4+CD25highTr鑒定采用藻紅蛋白(PE)結(jié)合的CD25-PE單克隆抗體和異硫氰酸螢光素(FITC)標記的CD4-FITC單克隆抗體,陰性對照為IgG2a-FITC和IgG1-PE;CD4+T細胞的鑒定分別采用CD4-FITC單克隆抗體,上述試劑均為美國BD公司產(chǎn)品。PE-CTLA-4配套染色試劑均購自eBioscience公司。流式細胞儀使用美國BD公司FACS Aria型。

1.2.2 人外周血單個細胞核細胞(PBMC)分離:采集3 mL靜脈血,EDTA抗凝。Hank′s液等體積稀釋,用 Ficoll液進行密度梯度離心(1 000 rpm,20 min),獲取PBMC,充分洗滌后用RPMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)整PBMCs濃度為2×106/mL。

1.2.3 CD4+CD25highTr和CD4+細胞的檢測:取上述制備好的細胞懸液100 μ L,分別加入熒光標記的單克隆抗體CD3、CD4、CD25各 10 μ L,4 ℃閉光孵育30 min。以PBS(磷酸鹽緩沖溶液)洗滌2次、離心1 500 rpm,8 min,上流式細胞儀先后檢測CD4+CD25highTr和CD4+T細胞,BD FACS專用FACSDIVA軟件分析。CD4+CD25highTr:以CD4-SS設門,分析門內(nèi)CD4+CD25highT r細胞亞群,每份標本計數(shù)5 000個CD4+T細胞,結(jié)果以CD4+CD25highTr細胞占CD4T細胞的百分率表示。CD4T細胞:重復上述步驟,結(jié)果以CD4+T細胞占CD3+T細胞的百分率表示。

1.2.4 CTLA-4的染色:將待測細胞用PBS洗滌2次后,加入1 mL細胞固定液,室溫固定7 min,PBS洗滌2次后加入200 μ L含有通透劑的緩沖液作用2 h,然后加入特異性的PE標記的抗CTLA-4單克隆抗體,4℃閉光反應30 min,洗滌2次,300 μ L染色緩沖液重懸細胞,應用流式細胞儀檢測,BDFACS專用FACSDIVA軟件分析,結(jié)果以CTLA-4陽性細胞占CD4+T細胞的百分率表示。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

CD組、UC組與健康對照組比較,結(jié)果見表1。

表1 IBD患者與健康對照者的結(jié)果比較

3 討 論

IBD包括CD與UC在內(nèi)的病因及發(fā)病機制均未闡明。眾多研究認為IBD可能系過度的T輔助性細胞(Th)反應所致?，F(xiàn)已了解,CD與UC分別均由CD4+T細胞(Th細胞)分化的Th1細胞或Th2細胞所介導[8]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)[3-6],機體內(nèi)存在的天然CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(CD4+CD25+regulatory T cell,Tregs)具有極強的免疫調(diào)節(jié)功能,可能是介導機體主動免疫耐受的主要細胞。CD4+CD25+Treg細胞通過分泌產(chǎn)生抗炎細胞因子IL-10和TGF-β發(fā)揮其免疫抑制效應,阻止和下調(diào)CD4+CD25+Treg細胞導致促炎性反應。CD4+CD25+Treg作為一組獨立功能的T細胞亞群,在免疫抑制機制和維持自身免疫耐受過程中起著重要作用。CD4+CD25+Treg細胞占外周血CD4+T細胞的5%～10%,但具有免疫調(diào)節(jié)或免疫抑制活性的細胞主要是高表達CD25+的CD4+T細胞,即CD4+CD25high調(diào)節(jié)性T細胞[9](CD4+CD25highTr)。CD4+CD25highTr細胞數(shù)量的減少、表面分子表達的缺陷、抑制功能的受損,都與IBD的發(fā)生相關。CD4+CD25highTr細胞通過分泌產(chǎn)生抗炎細胞因子IL-10和TGF-β發(fā)揮其免疫抑制效應,阻止和下調(diào)CD4+CD25highTr導致促炎性反應。

另一方面,細胞毒T淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4)(又稱CD152)與炎癥性疾病的關系已引起廣泛關注[10]。由于CTLA-4是T細胞激活的重要調(diào)節(jié)因子,CT LA-4是T細胞表面重要膜分子,CD4+CD25highTr細胞活化后CTLA-4的表達增加,并持續(xù)表達。CD4+CD25+Tr細胞的調(diào)節(jié)活性,有賴于CTLA-4分子的表達。它是一種抑制性調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)分子,很可能CD4+CD25highTr細胞是通過CTLA-4接受信號而被賦予了無應答表型和抑制功能。用抗CTLA-4單抗可阻斷 CD4+CD25highT r細胞的抑制作用。用同種異體細胞包被抗CTLA-4抗體增加CD4+CD25CTLA-4細胞數(shù)量,能抑制炎癥前因子IFN-γ和IL-2D的產(chǎn)生,上調(diào)IL-10、TGF-β及 IL-4。CD4+CD25+T 淋巴細胞和CD4+CD25-T淋巴細胞的共同培養(yǎng)體系中加入抗CTLA-4單抗可以明顯減輕前者對后者的抑制作用,而給予正常小鼠注射抗CTLA-4單抗或(和)抗CD25單抗則會出現(xiàn)一些免疫相關性疾病。提示CTLA-4可能在CD4+CD25+T細胞的分化或免疫抑制作用中發(fā)揮一定作用[11]。

本研究顯示,IBD患者外周血CD4+水平與對照組比較無明顯差異,外周血CD4+CD25highTr細胞及CT LA-4與IBD關系密切。IBD患者外周血CD4+CD25highTr細胞的比例明顯降低,說明調(diào)節(jié)性T細胞在病變時以CD4+CD25high水平下降為主,同時CT LA-4水平也明顯下降,提示 IBD患者的免疫異常與CD4+CD25highTr細胞下降和CTLA-4水平明顯下降密切相關。而CD4+CD25highTr細胞下降可能與CTLA-4水平密切相關。

綜上所述,本研究提示了CD4+CD25highTr、CTLA4等在IBD發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,為進一步揭示IBD的發(fā)病發(fā)展的機制提供了重要依據(jù)與線索。深入研究 IBD患者CD4+CD25highTr細胞與CTLA4相互關聯(lián),對于闡明IBD的發(fā)病機理及探索新的免疫治療途徑,具有重要的臨床意義。

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