小島肇夫

REACH法規(guī)的環(huán)境影響試驗法

小島肇夫

REACH法規(guī)是針對化學品及其安全性的一項新技術法規(guī)，它解決化學品的出口、評估、許可和限制事宜，為化學品提供更全面的安全性數(shù)據(jù)，旨在提高化學物質(zhì)對人類健康和環(huán)境的安全性。本文綜述了REACH關于生物毒性、降解性及環(huán)境影響的評價內(nèi)容，幫助企業(yè)加深對REACH的認識。

REACH；環(huán)境評價；OECD試驗指南

REACH是歐盟對在市場流通的現(xiàn)有化學物質(zhì)和新型化學物質(zhì)實施的一項法規(guī)，它要求供應商為所提供的化學物提供有關的安全性數(shù)據(jù)，并按指定要求履行登錄的義務，是注冊、評價、許可、限制的總稱。歐盟2007年開始提出相關要求，2008年6月開始運作，2018年6月完成年產(chǎn)量或進口量1噸以上化學物質(zhì)的注冊工作。本來，REACH只是歐盟的內(nèi)部事務，但如今已成為全球性的安全性評價問題，日本從不關心此事到為整個產(chǎn)業(yè)界積極采取對策，可見REACH法規(guī)對日本制造業(yè)的影響之大。

1 REACH要求的安全性資料

REACH的安全性評價包括毒理性和危險性（毒性和曝露性評價）兩項基本內(nèi)容，2009年底進行事前登錄的化學物質(zhì)約有18萬個，其中70%的試驗將在2011～2017年實施。

表1 REACH根據(jù)制造量/進口量列出的必須實施的危險性試驗方法

表1是根據(jù)制造量和進口量列出的必須實施的危險性試驗方法。在該試驗法中沒有對少量生產(chǎn)物質(zhì)的有害性試驗，對10t以上新型化學物質(zhì)的生產(chǎn)還要求進行曝露性的評價試驗。充分掌握表1所示試驗法的精髓對把握試驗結果非常重要。本文將主要討論與環(huán)境影響評價有關的試驗法及其選擇。

REACH的環(huán)境影響評價試驗法大致分為4類：1）對水生生物的影響；2）對活性污泥呼吸的抑制作用；3）在環(huán)境中的行為和結果；4）對陸生生物的影響。表2是化學物對水生生物的主要影響試驗法，超過1t的新型化學物必須進行無脊椎動物的急性毒性試驗和對水生物的生長抑制試驗；對于超過10t的新型化學物，還必須進行魚類的急性毒性試驗。但是，試驗物質(zhì)的溶解性是一項關鍵性指標，對溶解性低的場合，除進行急性毒性試驗外，還必須進行長期的毒性試驗；對100t以上的化學物質(zhì)，必須進行無脊椎動物和魚類的長期毒性試驗。REACH試驗法以選定生物群的生態(tài)機能為重點，從中選取感受性高的生物作為試驗對象，并以OECD試驗指南的方式推薦給用戶。表2是OECD試驗指南，表3是OECD指南收錄的主要文件。

2 環(huán)境影響評價試驗法概要

2.1 對水生生物的影響試驗

無脊椎動物、藻類、魚類常用作對水生生物影響的毒性試驗的評價對象。急性毒性試驗以能引起無脊椎動物、藻類、魚類死亡的濃度EC（有效作用濃度）和LC（致死濃度）為指標，慢性毒性試驗則以致死或成長和繁殖等指標來衡量。

表2 OECD收錄的與生態(tài)有關的試驗指南

表3 OECD收錄的與生態(tài)有關的試驗指南文件

2.1.1 用無脊椎動物進行的急性毒性試驗

OECD試驗指南202條推薦使用Daphnia magna（一種水蚤）作為急性游泳抑制試驗對象，這是由于水蚤對化學物質(zhì)的感受性較高之故。把水蚤暴露于含化學物質(zhì)的水中48h后，觀察水蚤的游泳狀態(tài)（以在運動的容器中靜止15s為限）。測定游泳試驗中的半數(shù)抑制濃度時，在含不同濃度化學物質(zhì)的水中放入出生時間在24h內(nèi)的水蚤幼蟲，24h和48h分別觀察水蚤幼蟲的致死量。

2.1.2 用水生生物進行生長抑制試驗

OECD試驗指南201條推薦以藻類為生長抑制試驗對象，藻類多使用小球藻等品種（藻類壽命很短，適合在短時間內(nèi)進行急性和慢性毒性評價）。試驗時，通常會考察藻類在含化學物質(zhì)的環(huán)境中曝露72h后，化學物對藻類生長性的影響，在含不同濃度化學物質(zhì)的水中按指數(shù)函數(shù)的比例放入藻類，在光照條件下培養(yǎng)72h，每24h測定一次存活的藻類數(shù)，由此可得到半數(shù)生長抑制濃度（EC50）和無影響濃度（NOEC）。

2.1.3 魚類急性毒性試驗

OECD試驗指南203條要求使用魚類（推薦Oryzias latipes、斑魚、鯉魚、食蚊魚、鮭魚）進行急性毒性試驗，觀察化學物對魚類生存性的影響。試驗時，在含不同濃度化學物質(zhì)的水中放入幼魚（0.1～5g），96h后測定幼魚的死亡數(shù)，測得半致死濃度LC50。

2.1.4 無脊椎動物的長期毒性試驗

OECD試驗指南211條要求使用水蚤作繁殖抑制性試驗，觀察水蚤在含化學物質(zhì)的水中曝露21天后對其繁殖性的影響。這種比較簡便的試驗方法常被用來進行有害性評價試驗。根據(jù)母水蚤的毒性癥狀和初次產(chǎn)仔日、幼蟲產(chǎn)出數(shù)、死亡數(shù)、產(chǎn)仔幼體的生存和死亡數(shù)，獲得半數(shù)繁殖抑制濃度EC50和無影響濃度NOEC。

2.1.5 魚類長期毒性試驗

本試驗分為三項，是REACH中必須檢測的項目。

1）魚類初期生活階段的毒性。OECD試驗指南210條要求選擇有代表性的受精卵孵化，在幼魚的初期生長階段使其曝露于含化學物質(zhì)的水中，期限為30天，觀察化學物質(zhì)對幼魚的慢性影響，試驗時把Oryzias latipes、斑魚、鮭魚等魚類的受精卵放入小槽，并與對照區(qū)的魚卵對比，觀察魚卵的孵化數(shù)、生存數(shù)、體型異常、行動阻害、體長及體重變化，從而求出最低有影響濃度（LOEC）及NOEC。

2）對胚胎、幼魚的短期毒性。OECD試驗指南第212條規(guī)定，選擇有代表性的受精卵孵化成幼魚，考察化學物質(zhì)的短期毒性。試驗時，把Oryzias latipes、斑魚、鮭魚等的受精卵放入水槽，每種幼魚的卵黃均被取出，對照區(qū)的幼魚出現(xiàn)因饑餓死亡的現(xiàn)象時試驗終止。測定累積死亡率、健康的幼魚數(shù)、孵化開始的天數(shù)、孵化數(shù)、成長等項目，得出LOEC及NOEC數(shù)值。

3）幼魚成長。OECD試驗指南215條規(guī)定選取有代表性的幼魚進行化學物質(zhì)曝露試驗。本試驗使用鮭魚作為試驗對象，在含化學物質(zhì)的水中曝露28天，測定鮭魚的體重、成長率，從而求得LOEC與NOEC數(shù)值。

魚類是各地區(qū)最常使用的試驗動物。圖1是ECVAM（歐洲動物實驗代替法檢驗中心）的評價程序，該機構建議盡可能少地使用魚類進行上述試驗，即：第一階段，先用水蚤和藻類進行實驗，根據(jù)得到的EC值再進行第二階段試驗；第二階段用低濃度化學物質(zhì)進行有限度的試驗，依據(jù)試驗結果得出該化學物的LC值。此外，ECVAM還嘗試用魚類細胞進行細胞毒性，用魚類胚胎進行魚的活體代替試驗。

圖1 ECVAM推薦的環(huán)境毒性評價程序

2.2 活性污泥呼吸抑制試驗

應用活性污泥作基體，觀察污泥在不同濃度的化學物質(zhì)下的呼吸率（喜氧性污泥對廢水中微生物的消耗量），從而評價化學物質(zhì)對微生物的影響。試驗中選用污水處理廠的活性污泥，測定30min和3h后的氧消耗量，確定化學物質(zhì)的半數(shù)呼吸抑制濃度（EC50）。生物分解性試驗（OECD指南301A-F）中，以相當于EC50的1/10的濃度考察化學物質(zhì)對活性污泥的影響，其中生物分解性試驗中的濃度參照活性污泥呼吸抑制試驗中的NOEC值確定。

2.3 在環(huán)境中的行為和結果

化學物質(zhì)在環(huán)境中的分解性、蓄積性等環(huán)境命運性數(shù)據(jù)，除了化學物質(zhì)的長期環(huán)境影響評價外，PBT（持續(xù)生物累積與有毒化學物質(zhì)）/vPvB（最大持久和生物累積）的評價同樣重要。加水分解試驗是反映非生物分解的方法，化學物質(zhì)的生物分解性則可從易分解性試驗與生物濃縮度試驗進行考察。

2.3.1 加水分解試驗

為了得到化學物質(zhì)非生物分解性的相關信息，本試驗將化學物質(zhì)在環(huán)境表層水中的殘留狀況及其影響作為判斷的依據(jù)。加水分解試驗與pH有關，OECD指南111條規(guī)定了化學物質(zhì)在指定緩沖液（pH）下的加水分解測定方法。預備試驗：在50℃、pH4、7、9反應5天，如果化學物質(zhì)的分解性＜10%，則認為該化學物質(zhì)是穩(wěn)定的；如果分解性＞10%，則在0～40℃、pH4、7、9條件下，選擇合適溫度再次進行類似試驗，確認其穩(wěn)定性。

2.3.2 易分解性試驗

OECD指南第301條規(guī)定了易分解化學物質(zhì)的篩選試驗方法，相關試驗包括：A）Doc Die-Awauy試驗；B）CO2發(fā)生試驗；C）改進的MITI試驗；D）閉瓶試驗；E）改進的OECD篩選試驗；F）測壓呼吸試驗。在DOC試驗中，經(jīng)過28天曝露后，如果該化學物質(zhì)的分解率＞70%，則認為它易于降解。這是因為，BOD試驗中將理論分解率最高估設為60%，超過此值則判定該化學物易于分解。

2.3.3 濃縮度試驗

OECD指南第305條推薦用魚類考察化學物質(zhì)在生物體內(nèi)的濃縮度。在流動水的條件下，以不少于兩種濃度（根據(jù)魚類急性毒性試驗得到的LC50值的1/100～1/ 10000選擇2種盡可能低的濃度）曝露28天，依據(jù)測定的數(shù)值求出化學物質(zhì)在魚體內(nèi)的濃縮倍率。

2.4 對陸生生物的影響

OECD指南第218和219條規(guī)定采用搖蚊毒性試驗，評價化學物對底層生物的影響。試驗是在底質(zhì)中添加化學物質(zhì)后，把Chironomus Yoshimatsui（搖蚊的一種）卵化后一歲的幼蟲置于底質(zhì)中，當幼蟲出現(xiàn)羽化時，測定化學物質(zhì)對幼蟲成長及羽化率的影響。

化學物質(zhì)對鳥類的影響，則是依據(jù)OECD指南第206條規(guī)定，以適量的化學物質(zhì)投食母鳥與雛鳥，進而考察化學物質(zhì)對鳥類繁殖性的影響。試驗推薦選用鴨、科林鵪鶉、鵪鶉中的1種以上鳥類，根據(jù)死亡率、中毒性、母鳥雛鳥體重、攝餌量確定LOEC與NOEC值。

2.5 其他

土壤對化學物質(zhì)的吸附試驗：對10t以上的化學物質(zhì)，依據(jù)吸附/脫附篩選試驗（OECD指南121高速液相色譜法測定的土壤吸附系數(shù)）進行；對100t以上的化學物質(zhì)，依據(jù)吸附/脫附追加試驗（OECD指南106：批量反應平衡吸附/脫附法）實施。對100t以上的化學物質(zhì)，還需進行在表層水中的最終分解試驗（OECD指南309）、土壤模擬試驗（OECD指南308）和底質(zhì)模擬試驗（OECD指南307）三項試驗。

3 總結

REACH法規(guī)名義上是一項針對化學物質(zhì)環(huán)境安全性的規(guī)定，實際上它還是化學品的環(huán)境準入門檻。日本環(huán)境省和國立環(huán)境研究所對OECD試驗法的確立給予了大力支持，以下幾項試驗是國立環(huán)境研究所對OECD試驗法作出的貢獻：①21天的魚類篩選試驗；②用水蚤為試驗對象的試驗方法；③用魚類培養(yǎng)細胞進行試管內(nèi)試驗法匯總；④協(xié)同REACH對兩生類動物研討。作為歐盟以外的國家，日本充分把握與自身出口產(chǎn)品相關的REACH動向，以幫助本國企業(yè)快速應對REACH的影響。

岳霄編譯自日本FRAGRANCE JOURNAL，2009.8