姜 彬，馮志彪

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系，黑龍江哈爾濱150030）

用于有機(jī)磷農(nóng)藥檢測的植物酯酶生物傳感器的研究

姜 彬，馮志彪*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系，黑龍江哈爾濱150030）

報道了一種用于有機(jī)磷農(nóng)藥檢測的電流型生物傳感器。從小麥中提取植物酯酶，純化后作為生物傳感器的酶源，以CuTAPC/SWCNT/GC修飾電極為基體電極，采用氣相沉積法制備TiO2凝膠，通過凝膠包埋法制備植物酯酶生物傳感器。該傳感器具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。當(dāng)對硫磷、辛硫磷和氧化樂果濃度分別在0.5×10-9～1×10-5、10-9～10-5、0.5×10-8～10-5mol/L范圍內(nèi)時，抑制率與其濃度的對數(shù)呈線性關(guān)系，檢測限分別為3.24×10-10、1.26 ×10-9、6.60 ×10-9mol/L。

生物傳感器，植物酯酶，有機(jī)磷農(nóng)藥，檢測

Abstract：An amperometric biosensor for the determination of organophosphorus pesticide was described.The biosensor was based on plant esterase which was extracted from wheat.After purificated，the plant was immobioled on CuTAPc/SWCNT/GC electrode by a vapor depositive titania sol-gel film.The biosensor exhibited a good reproducibility and recovery ratio.The inhibition versus the logarithm of concentration was linear to parathion，phoxim and omethoate over the concentration ranges of 0.5 ×10-9～1 ×10-5mol/L，10-9～10-5mol/L and 0.5 ×10-8～10-55mol/L with the detection limits of 3.24 ×10-10，1.26 ×10-9and 6.60 ×10-9mol/L，respectively.

Key words：biosensor；plant esterase；organophosphorus pesticide；determination

我國是農(nóng)藥生產(chǎn)和使用大國，使用農(nóng)藥所造成的環(huán)境污染和食品中的殘留問題，正日益受到政府和公眾的關(guān)注。近年來，隨著生物傳感技術(shù)的迅猛發(fā)展，酶生物傳感器以簡單、廉價、易于微型化等優(yōu)勢成了有機(jī)磷農(nóng)藥（OPs）傳統(tǒng)分析方法的最佳替代品。以往的酶生物傳感器研究集中在動物膽堿酯酶上［1-3］，但動物膽堿酯酶價格昂貴、不易保存，檢測成本較高，限制了其應(yīng)用。與動物膽堿酯酶相比，植物酯酶具有酶源廣泛、價格低廉等優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)過純化的植物酯酶對農(nóng)藥的敏感程度可與膽堿酯酶相媲美，目前基于植物酯酶抑制法測定有機(jī)磷農(nóng)藥的研究已有很多，但多采用的是分光光度法或紙片法，基于植物酯酶的生物傳感器的研究尚未見報道。本文從小麥中提取植物酯酶，純化后作為生物傳感器的酶源，以CuTAPc/SWCNT/GC修飾電極為基體電極，采用氣相沉積法將植物酯酶包埋于TiO2凝膠中，制備了用于有機(jī)磷農(nóng)藥檢測的植物酯酶生物傳感器，并對該生物傳感器的制備及應(yīng)用進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

α-萘酚、固蘭鹽 B、α-乙酸萘酯 fluka；鈦酸異丙酯 國藥集團(tuán)上海試劑公司；40%氧化樂果、對硫磷、辛硫磷 山東曹達(dá)化工有限公司；單壁碳納米管

深圳納米港；東農(nóng)黑小麥 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)。

PASTAT30型電化學(xué)工作站AUTOLAB；nHS-25型酸度計 上海精科雷磁；KQ-500DV數(shù)控超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 植物酯酶的提取

取適量小麥粉碎至均勻粉粒狀，稱取5g小麥粉按照1∶5（w/w）的比例加入蒸餾水，磁力攪拌30min，再以3000r/min離心30min，棄去沉淀，取上清液依次用0.65、0.45μm的微孔濾膜過濾，即得到粗制的小麥酶液。將粗酶液經(jīng)23%（w/w）PEG/16%（w/w）NaH2PO4雙水相體系萃取后，依次經(jīng) SephadexG-150FF凝膠柱層析和Procainamide親和凝膠柱層析純化后得到純化植物酯酶酶液，冷凍干燥后，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 CuTAPc/SWCNT/GC修飾電極的制備

將SWCNT樣品按文獻(xiàn)［4］方法處理后，用水配成1mg/mL的溶膠備用。玻碳電極先用HNO3（68%，分析純）、KOH、超純水依次清洗，然后用 0.3μm 和0.05μm的Al2O3的懸濁液拋光成鏡面，再分別用丙酮、無水乙醇、超純水超聲波清洗。電極在空氣中風(fēng)干后，在電極表面滴加一定量的SWCNTs水溶膠，干燥后置于含有5×10-3mol/L CuTAPc單體和0.1mol/L高氯四丁銨（TBAP）的支持電解質(zhì)的N，N-二甲基甲酰胺溶液（DMF）溶液中，-0.4～0.9V循環(huán)伏安掃描若干次，制得CuTAPc/SWCNT/GC修飾電極，然后依次用丙酮和蒸餾水清洗電極。

1.4 傳感器的制備

取適量植物酯酶溶液滴加到CuTAPc/SWCNT/GC修飾電極表面，然后將電極置于盛有鈦酸異丙酯液體的密閉容器中，使電極表面垂直懸掛在液體上方，25℃下恒溫放置 6h，密閉容器內(nèi)的飽和Ti（i-PrO）4蒸氣被電極表面的酶溶液吸收，在電極表面緩慢形成TiO2凝膠膜，同時植物酯酶被包埋于凝膠膜中，得到植物酯酶生物傳感器，將所制備的傳感器用超純水反復(fù)沖洗后，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

電化學(xué)測試前，先將傳感器在PBS緩沖溶液中浸泡5min以洗去未結(jié)合的酶液。植物酯酶傳感器為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對電極，將三電極體系浸入到0.1mol/L pH=6.0的PBS緩沖溶液中，掃描至背景電流穩(wěn)定后，加入α-乙酸萘酯溶液，使其濃度達(dá)到2×10-5mol/L，30℃下攪拌10min，加入適量CTAB使其濃度達(dá)到0.05%，在靜止的溶液中記錄產(chǎn)生的循環(huán)伏安掃描（掃描范圍0～0.8V，掃描速率100mV/s），記錄峰電流 I0，在另一份磷酸鹽緩沖溶液中加入一定濃度的農(nóng)藥，溫育15min后，加入同樣濃度的乙酰硫代膽堿溶液，測得峰電流I1。計算出各種濃度的農(nóng)藥相對應(yīng)的峰電流的衰減值，并根據(jù)下式計算農(nóng)藥對植物酯酶生物傳感器的抑制率：

抑制率I（%）=（I0-I1）/I0×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 支持介質(zhì)的影響

研究了在不同種類的電解質(zhì)溶液HAc-NaAc緩沖液、NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液、Tris-HCl緩沖液、B-R緩沖液對傳感器檢測的影響，結(jié)果表明，該傳感器在pH=6.0的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液中響應(yīng)信號最好，酶活最大。

2.2 修飾電極的電化學(xué)性質(zhì)

植物酯酶傳感器的循環(huán)伏安曲線如圖1，與在空白溶液中的循環(huán)伏安曲線相比，在α-乙酸萘酯溶液中的循環(huán)伏安曲線中在0.4V左右出現(xiàn)明顯的氧化峰，說明制得的生物傳感器對α-乙酸萘酯的水解有明顯的催化作用。

圖1 植物酯酶傳感器在α-乙酸萘酯溶液中的循環(huán)伏安曲線

2.3 pH對傳感器響應(yīng)電流的影響

酶的活性與pH有關(guān)，每種酶都有適合的pH范圍，通常是在一定pH下其活性最大，稱為最適pH。植物酯酶的最適pH是6.5左右，但固定化后，由于其所處的外部環(huán)境發(fā)生變化，最適pH可能會發(fā)生變化。圖2是傳感器在不同pH的相同濃度的底物溶液中的響應(yīng)電流。由圖2中可以看出，pH=6.0時傳感器的響應(yīng)電流達(dá)到最大，說明固定化后植物酯酶的最適pH為6.0。

圖2 pH對響應(yīng)電流的影響

2.4 底物濃度的影響

不同濃度α-乙酸萘酯溶液的響應(yīng)電流如圖3所示，可以看出，在α-乙酸萘酯濃度較低的情況下，響應(yīng)電流值與α-乙酸萘酯的濃度成良好的線性關(guān)系，其線性方程為 y=3.7x+0.934，但濃度超過0.05mmol/L之后，線性關(guān)系不明顯，響應(yīng)電流增大的趨勢變緩，這是因?yàn)榇藭r酶的催化能力已達(dá)到飽和，受底物濃度影響不大，因此選擇0.05mmol/L作為農(nóng)藥測定的最適底物濃度。

圖3 底物濃度對響應(yīng)電流的影響

2.5 給酶量和固定化時間的影響

傳感器制備時，植物酯酶的負(fù)載量對傳感器的響應(yīng)有著重要影響。用量太少，傳感器的響應(yīng)電流太小，影響檢測的靈敏度；用量太大會造成試劑的浪費(fèi)。圖4是載有不同量的植物酯酶的生物傳感器在相同溶液中的響應(yīng)情況。可以看出，負(fù)載量為25μL酶溶液的傳感器的峰電流達(dá)到最大，即使繼續(xù)增加酶的負(fù)載量，電流也不再增大，當(dāng)?shù)孜餄舛容^小時，甚至出現(xiàn)下降的趨勢，此時酶制劑已達(dá)到飽和，酶促反應(yīng)主要受底物濃度的限制，且酶的負(fù)載量太大還可能導(dǎo)致空間位阻增大，影響電子在電極表面的傳遞，致使響應(yīng)電流降低。故選擇25!L作為最佳給酶量。

圖4 給酶量對響應(yīng)電流的影響

固定化時間的長短直接影響到凝膠膜的厚度，對傳感器的穩(wěn)定性和靈敏度有著重要的影響，凝膠膜太薄，則在測定過程中酶容易脫落，引起酶的流失，使傳感器的穩(wěn)定性下降；凝膠膜過厚時，電極表面電阻太大，妨礙電子的傳遞。

表1是不同固定化時間制得的生物傳感器對相同溶液進(jìn)行10次重復(fù)測定所得峰電流的相對平均偏差，圖5是不同固定化時間制得的生物傳感器對不同底物濃度的溶液進(jìn)行測定得到的峰電流。由表1和圖5可知，固定化時間為6h時，所得的傳感器穩(wěn)定性和靈敏度均較好，因此選擇6h為凝膠固定時間。

圖5 固定化時間對響應(yīng)電流的影響

表1 固定化時間對傳感器穩(wěn)定性的影響

表2 三種有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測參數(shù)

2.6 抑制時間的影響

實(shí)驗(yàn)表明，選用的兩種有機(jī)磷農(nóng)藥對植物酯酶的抑制作用在開始的5min內(nèi)迅速增強(qiáng)，至10min時，抑制作用已完成99%，故選擇10min作為有機(jī)磷農(nóng)藥對植物酯酶的抑制時間。

2.7 農(nóng)藥的測定

以抑制率I（%）對農(nóng)藥濃度對數(shù)作圖，結(jié)果表明，二者在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。按抑制率為10%時的農(nóng)藥濃度為檢測限，以信噪比的3倍為最低檢出濃度，檢測參數(shù)如表2所示。在不同測定范圍內(nèi)，考察了傳感器農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)的重現(xiàn)性（以抑制率的大小為指標(biāo)）。使用同一支傳感器對相同濃度的農(nóng)藥溶液進(jìn)行10次平行測定，其相對平均偏差不超過6.13%，按照同樣的方法制備10支傳感器對相同濃度的農(nóng)藥溶液進(jìn)行平行測定，其相對平均偏差不超過3.48%，說明該方法具有良好的精密度，完全可以滿足測定要求。

2.8 樣品的測定

自行培育白菜樣品四組，在生長過程中分別噴灑適量2mmol/L對硫磷、辛硫磷、氧化樂果和敵敵畏農(nóng)藥，即得到含有四種農(nóng)藥殘留的蔬菜樣品。

稱取50.00g試樣，切成1cm2左右的小塊，置于300mL燒杯中，加入50mL水和100mL丙酮，用組織搗碎機(jī)提取1～2min。勻漿液經(jīng)鋪有二層濾紙和約10g Celite 545的布氏漏斗減壓抽濾。從濾液中分取100mL移至500mL分液漏斗中，加入10～15g氯化鈉使溶液處于飽和狀態(tài)。猛烈振搖 2～3min，靜置10min，使丙酮從水相中鹽析出來，水相用50mL二氯甲烷振搖2min，再靜置分層。將丙酮與二氯甲烷提取液合并，再以約40mL二氯甲烷分?jǐn)?shù)次洗滌容器和氯化鈉，洗滌液也并入燒瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至約2mL，濃縮液定量轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，定容至刻度。

由表3中可以看出，樣品的加標(biāo)回收率介于95.8%～107.8%之間，說明該方法用于實(shí)際樣品的檢測具有較好的效果。

表3 實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率

3 結(jié)論

本文以CuTAPC/SWCNT/GC修飾電極為基體電極，通過TiO2凝膠包埋法制備植物酯酶生物傳感器。該傳感器對硫磷、辛硫磷和氧化樂果的檢測限分別為3.24×10-10、1.26 ×10-9和 6.60 ×10-9mol/L，且具有較好的穩(wěn)定性，具有一定應(yīng)用前景。

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Study on biosensor based on plant esterase for determination of organophosphorus pesticide

JIANG Bin，F(xiàn)ENG Zhi-biao*
（College of Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

TS201.1

A

1002-0306（2010）10-0364-04

2009-10-20 *通訊聯(lián)系人

姜彬（1977-），男，講師，在讀博士，研究方向：化學(xué)，食品科學(xué)。