武鑫,劉金龍,李生泉

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院,山西 太谷030801;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 現(xiàn)代教育技術(shù)學(xué)院,山西太谷 030801)

現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展及分子生物學(xué)在臨床診斷中的應(yīng)用,已證明許多疾病的發(fā)生,尤其是目前困擾人類的癌癥等都與體內(nèi)的遺傳物質(zhì)-DNA的變化有著密切的關(guān)系[1],所以定量測(cè)定是詮釋其結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)。目前,測(cè)定DNA的方法有分光光度法[2],熒光分析法[3～5],電化學(xué)發(fā)光法[6]及電化學(xué)法[7]等。熒光分析法具有靈敏度高、選擇性好、操作方便等優(yōu)點(diǎn),在生物分析中已有廣泛的應(yīng)用。但DNA本身的熒光很弱,直接運(yùn)用其熒光發(fā)射來研究它的結(jié)構(gòu)和生物活性受到限制,必須引入熒光探針[8]。

許多染料探針可以和DNA發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用,是一類可以利用的DNA探針。染料剛果紅(CR)與DNA作用方面雖有人做過研究[9～10],但側(cè)重于對(duì) DNA作用方式的研究,而對(duì)于DNA含量的分析測(cè)試研究甚少。實(shí)驗(yàn)研究了CR與DNA反應(yīng)的基本條件,建立了以CR測(cè)定DNA的熒光光度分析法及相應(yīng)的研究體系。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

970 CRT熒光分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);雷磁p HS-2C型酸度計(jì),超聲波清洗機(jī)。

ctDNA(中國(guó)科學(xué)院北京百泰生化技術(shù)公司):配成1.0×10-4g·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)液,冰箱中4℃保存?zhèn)溆?羊駝血液DNA濃縮液,由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院提供;CR儲(chǔ)備液(1.0×10-3mol·L-1):使用時(shí)稀釋為1.0×10-4mol·L-1的工作液;0.1 mol·L-1的 Tris-HCl緩沖液(p H=7.4);CTMAB:1.0×10-3mol·L-1;實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在22～25℃下,向25 mL容量瓶中依次加入1.0 mL pH=7.4的 Tris-HCl緩沖溶液,2.0 mL 1.0×10-4mol·L-1的CR工作液,0.8 mL 1.0×10-3mol·L-1的CTMAB及不同體積的ctDNA溶液,用蒸餾水稀釋至刻度,搖勻,充分振蕩,室溫靜置40 min,測(cè)定F325/613nm,不加ctDNA,按上述步驟做空白試驗(yàn),測(cè)定熒光強(qiáng)度F0值。令ΔF=FF0,以ΔF作為測(cè)定ctDNA的信號(hào)響應(yīng)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光光譜特征

圖1為體系的熒光光譜。由圖可知,CR本身在613 nm處有弱的熒光峰,當(dāng)CTMAB加入時(shí)CR熒光強(qiáng)度有所增強(qiáng),而當(dāng)ctDNA再加入時(shí)熒光強(qiáng)度大了很多,表明CR、CTMAB和ctDNA三者發(fā)生了相互作用,形成了大的聚集體,使體系的熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)。因此隨后的實(shí)驗(yàn)中我們選擇λem=613 nm作為工作波長(zhǎng)。

2.2 反應(yīng)條件

2.2.1 pH的影響

實(shí)驗(yàn)考察了pH 4～10范圍內(nèi)體系的熒光強(qiáng)度。結(jié)果如圖2所示,在pH 7～8范圍內(nèi)體系的ΔF值較大且穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)選用0.1 mol·L-1的Tris-HCl緩沖液(p H 7.4)1 mL。

圖 1 體系的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra of system

圖2 p H對(duì)△F的影響Fig.2 Effect of p H

2.2.2 CR的用量

固定pH為7.4的Tris-HCl 1.0 mL,ctDNA的濃度為1.0×10-6g·mL-1,考察了CR的濃度在4.0×10-7～4.0×10-5mol·L-1范圍內(nèi)對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響。圖3表明,當(dāng)濃度為8.0×10-6mol·L-1時(shí)體系的ΔF值最大,當(dāng)濃度再加大時(shí)體系的ΔF值隨濃度的增加而顯著降低,本實(shí)驗(yàn)選擇CR的濃度為8.0×10-6mol·L-1。

圖3 剛果紅濃度ΔF的影響Fig.3 Effect of CR concentration

2.2.3 CTMAB的用量

CTMAB對(duì)CR與ctDNA結(jié)合后的熒光強(qiáng)度有增強(qiáng)作用。圖4表明,CTMAB的濃度較小時(shí),體系的ΔF值隨CTMAB濃度的增加而增加,在3.2×10-5mol·L-1時(shí) ΔF值達(dá)到最大,CTMAB濃度再增大時(shí),體系的 ΔF值下降,本實(shí)驗(yàn)選擇CTMAB的濃度為3.2×10-5mol·L-1。

圖4 CTMAB濃度對(duì)ΔF的影響Fig.4 Effect of CTMAB concentration

2.2.4 試劑的添加順序

本實(shí)驗(yàn)對(duì)試劑的添加順序做了研究(見表1)。結(jié)果顯示,先將Tris-HCl緩沖溶液與CR混合,再加入表面活性劑CTMAB和ctDNA效果最好,這是因?yàn)榫彌_溶液為CR與CTMAB和ctDNA的結(jié)合提供了適宜的p H環(huán)境,所以能產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度。本實(shí)驗(yàn)選擇試劑的添加順序?yàn)門ris-CRCTMAB-ctDNA。

表1 試劑添加順序?qū)w系ΔF的影響Table 1 Effect of order of adding reagents

2.2.5 離子強(qiáng)度

ctDNA的雙鏈之間因磷酸基團(tuán)帶負(fù)電荷而產(chǎn)生靜電斥力。實(shí)驗(yàn)表明,在固定體積下,隨著NaCl濃度的增大,體系的熒光強(qiáng)度有所減弱,但其變化值不大(見圖5)。這是因?yàn)轶w系中存在NaCl時(shí),隨著鈉離子濃度的增加,減小了負(fù)電性DNA磷酸骨架間的勢(shì)電斥力,使DNA鏈變緊,有機(jī)分子不易嵌入DNA堿基對(duì)間的結(jié)合位點(diǎn),而被排斥游離在溶液中。所以隨著溶液中NaCl濃度的增加影響了DNA的存在狀態(tài),從而影響了CR與DNA的相互作用,釋放了部分原來可以與DNA結(jié)合的CR,從而使該體系的熒光強(qiáng)度減弱,而變化值不大是因?yàn)镹aCl對(duì)DNA的作用是有限的,它只能在一定程度上使DNA鏈變緊,所以隨著NaCl濃度的進(jìn)一步增加不能導(dǎo)致更多的CR釋放出來,該體系的熒光強(qiáng)度逐漸趨于穩(wěn)定。

圖5 離子強(qiáng)度對(duì)體系F的影響Fig.5 Effect of ion strength

2.2.6 干擾離子

實(shí)驗(yàn)還考察了常見金屬離子等對(duì)測(cè)定的干擾情況。表2表明:金屬離子在較高的濃度下(相對(duì)ctDNA的濃度而言)對(duì)測(cè)定體系的ΔF值影響較小。

表2 干擾離子的影響Table2 Effect of interfering ions

2.3 工作曲線

優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下,ctDNA的濃度在0.005～3.60 mg·L-1范圍內(nèi)時(shí),熒光的增強(qiáng)程度與ctDNA濃度呈線性關(guān)系,回歸方程為:ΔF=131.22c+3.854 3(c:mg·L-1),r=0.9988,根據(jù)空白的平均值加上3倍的空白標(biāo)準(zhǔn)偏差即為檢出限,可求得檢出限為0.01 mg·L-1。

2.4 樣品的測(cè)定

本體系對(duì)羊駝血液中DNA的測(cè)定,測(cè)定的平均RSD為2.4%,并同紫外分光光度法測(cè)定進(jìn)行了比較,結(jié)果同一個(gè)樣品用兩種方法測(cè)定的結(jié)果分別為0.594 mg·L-1和0.500 mg·L-1,這表明本方法有較好的準(zhǔn)確度。在實(shí)際樣品測(cè)定時(shí),ctDNA加入回收率為96.25%～102.50%(見表3)。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)首次采用剛果紅做熒光探針利用熒光光度法建立了一種測(cè)定ctDNA的新體系:CR-CTMAB-ctDNA,并將本方法首次成功地應(yīng)用于羊駝血液中DNA的測(cè)定,結(jié)果令人滿意。

表3 實(shí)際樣品中ctDNA加入的回收率Table3 Recovery of ctDNA in real samples

測(cè)定ctDNA含量的方法很多,但熒光分析法具有靈敏度高、選擇性好、操作方便等優(yōu)點(diǎn),在生物分析中應(yīng)用廣泛。本實(shí)驗(yàn)中選用的熒光探針CR是價(jià)廉、易得的,并且從實(shí)驗(yàn)中得到的相關(guān)系數(shù)、檢出限和回收試驗(yàn)等數(shù)據(jù)說明該方法準(zhǔn)確、可靠,所以本實(shí)驗(yàn)方法是可推行的。對(duì) CR、CTMAB與ctDNA之間的相互作用方式還有待進(jìn)一步研究。

[1]慈云祥,常文保,帖建科,等.化學(xué)發(fā)光在脫氧核糖核酸探針雜交技術(shù)中的應(yīng)用[J].分析化學(xué),1992,20(9):1100-1106.

[2]方光榮,宋功武,李瑛.用結(jié)晶紫測(cè)定DNA的分光光度法[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2000,19(2):45-46.

[3]葉寶芬,朱永林.DNA與苯胺紅 T的相互作用與熒光定量檢測(cè)[J].高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào),2002,23(12):2252-2255.

[4]陳敬華,張靜,莊惠生,等.10-苯基-3-磺酸基-吖啶酮測(cè)定 DNA的熒光分析新體系研究[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2006,25(2):13-15.

[5]敖登高娃,斯琴,趙永亮.Gatifloxacin銪熒光探針測(cè)定DNA[J].中國(guó)稀土學(xué)報(bào),2008,26(1):51-54.

[6]朱霞萍,汪敬武,傅敏恭.流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光測(cè)定人體血清中的DNA[J].分析試驗(yàn)室,2004,23(5):50-53.

[7]冶保獻(xiàn),劉靈芳,齊小花,等.有機(jī)小分子硫堇與DNA相互作用的研究[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào),2003,19(1):51-53.

[8]凌連生,何治柯,曾云鶚.脫氧核糖核酸熒光探針的研究進(jìn)展[J].分析化學(xué),2001,29(6):721-724.

[9]Chi Yanhua,Zhuangjia,Xue Qibin,et al.Study on the chemical reaction of DNA with Congo red[J].Spectr oscopy and Spectral Analysis,2006,26(1):97-101.

[10]王興明,費(fèi)丹,黎泓波,等.剛果紅與鯡魚精 DNA相互作用的光譜法和電化學(xué)研究[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào):工程科學(xué)版,2009,41(5):97-102.