李 娟 李萬(wàn)寧 唐 懿 李煥秀*

（1四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，四川雅安 625014；2四川省雙流縣農(nóng)村發(fā)展局，四川雙流 610200）

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的西瓜遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展

李 娟1李萬(wàn)寧2唐 懿1李煥秀1*

（1四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，四川雅安 625014；2四川省雙流縣農(nóng)村發(fā)展局，四川雙流 610200）

介紹了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的西瓜遺傳轉(zhuǎn)化的研究現(xiàn)狀，綜述了西瓜高效再生體系的建立和遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中的主要影響因素，包括最佳外植體的選擇、最適培養(yǎng)基的制備，以及抗生素、農(nóng)桿菌菌株類型、菌液濃度、侵染時(shí)間、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間和添加乙酰丁香酮等內(nèi)容，討論了西瓜遺傳轉(zhuǎn)化存在的問(wèn)題，并對(duì)這一體系的發(fā)展進(jìn)行了展望。

西瓜；遺傳轉(zhuǎn)化；根癌農(nóng)桿菌；綜述

近年來(lái)，人們已成功利用植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法將多種目的基因?qū)胫参?，其中許多有價(jià)值的轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)或即將應(yīng)用于生產(chǎn)。西瓜〔Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum. et Nakai〕是重要的經(jīng)濟(jì)作物，屬葫蘆科植物，其果實(shí)汁多味甜、營(yíng)養(yǎng)豐富（張志忠 等，2005a），但遺傳基礎(chǔ)十分狹窄（許勇 等，1999），栽培種和野生種中抗病種質(zhì)資源極為缺乏（林德佩，2003），通過(guò)常規(guī)育種方法選育抗病性穩(wěn)定的品種較為困難?；蚬こ虨榕嘤龈弋a(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病蟲、抗逆境的優(yōu)良品種開辟了新途徑，其中研究最清楚和應(yīng)用最成功的是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，在已獲得的近200種轉(zhuǎn)基因植物中約80 %是由農(nóng)桿菌介導(dǎo)完成的（王關(guān)林和方宏筠，1998a）。從已有的報(bào)道來(lái)看，該技術(shù)在西瓜上的應(yīng)用有一定困難（Chen et al.，1998；任春梅和董延瑜，2000a；Ellul et al.，2003；Sang et al.，2005；），這可能與西瓜再生能力較弱、不易通過(guò)愈傷組織途徑再生植株、遺傳轉(zhuǎn)化體系難以優(yōu)化等有關(guān)。筆者對(duì)西瓜再生體系、轉(zhuǎn)基因技術(shù)在西瓜育種上的應(yīng)用進(jìn)行了綜述和展望。

到目前為止，已用于西瓜遺傳轉(zhuǎn)化的常用外源基因主要有以下三類：第一類是標(biāo)記基因，如β-葡糖甘酸酶（GUS）基因、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（NPTⅡ）；第二類是抗病基因，包括西瓜花葉病毒1號(hào)（WMV-1）、西瓜花葉病毒2號(hào)（WMV-2）、西葫蘆黃化花葉病毒（ZYMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）；第三類是總dNA，包括抗枯萎病南瓜總dNA、抗枯萎病瓠瓜總dNA、銀杏總DNA和pBll21dNA。這些基因在西瓜上的利用主要是為了建立有效的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

1 西瓜高效再生體系的建立

1.1 最佳外植體的選擇

從理論上講，每一個(gè)植物細(xì)胞都有再生成完整植株的能力，即細(xì)胞全能性。但在實(shí)際應(yīng)用中，西瓜組織的再生受植株基因型、種子貯藏年限、苗齡、外植體的大小和部位等多種因素的影響，其再生能力差別很大。很多研究證明西瓜的品種特性是影響轉(zhuǎn)基因操作取得成功的關(guān)鍵，選擇合適的轉(zhuǎn)化受體很重要（Sparrow et al.，2004），西瓜子葉外植體具有高效的轉(zhuǎn)化再生頻率，被廣泛用于轉(zhuǎn)基因再生體系。

1.1.1 外植體基因型 適宜作為外源基因受體的植物細(xì)胞，應(yīng)具備兩個(gè)必需的條件：① 能夠產(chǎn)生創(chuàng)傷信號(hào)分子，刺激農(nóng)桿菌向植物細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，并使農(nóng)桿菌 vir基因活化和表達(dá)；② 具有脫分化和再分化能力，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞經(jīng)離體培養(yǎng)能再生成完整植株。這兩個(gè)特點(diǎn)都和植物的種屬以至品種（基因型）有直接關(guān)系。

王果萍（2002）以西瓜自交系F-18、F-22、F-37為試驗(yàn)材料進(jìn)行組織培養(yǎng)，結(jié)果品系間營(yíng)養(yǎng)胚誘導(dǎo)的難易程度表現(xiàn)出明顯的差異，F(xiàn)-18較其他品系容易誘導(dǎo)，誘導(dǎo)分化率達(dá)60.24 %，且易獲得再生植株，能夠滿足基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的需要。張明方等（2006）采用浙蜜2號(hào)西瓜品種進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明西瓜子葉外植體在無(wú)Kan的MS培養(yǎng)基中再生率可達(dá)95 %。郝立新和王懷名（1998）以京欣1號(hào)、查理斯頓、巨人、井神小西瓜、黑崩筋5個(gè)品種的子葉為外植體，建立了西瓜品種無(wú)性繁殖系和高效培養(yǎng)體系，芽誘導(dǎo)率為46.6 %～94.0 %，其中巨人的誘導(dǎo)率最高，井神小西瓜和黑崩筋次之。孫治圖等（2008）以23種基因型材料的西瓜無(wú)菌苗子葉為試材，運(yùn)用方差分析篩選高效基因型材料。結(jié)果表明：基因型不同的材料，誘導(dǎo)效果有明顯差異。篩選的再生高效基因型為魯圓、三白、FW351、PM2和京母。魯圓誘導(dǎo)效果最好，最高誘導(dǎo)率達(dá)到90.0 %；三白、FW351、PM2和京母的誘導(dǎo)效果次之，誘導(dǎo)率分別為85.0 %、82.5 %、82.5 %和80.0 %。鄭先波等（2005）對(duì)無(wú)籽西瓜的成熟胚的無(wú)菌萌發(fā)條件進(jìn)行了系統(tǒng)研究，結(jié)果表明：無(wú)籽西瓜成熟胚在無(wú)菌條件下萌發(fā)生長(zhǎng)與品種基因型沒(méi)有必然的聯(lián)系，只要成熟胚在適宜的光、溫、水、氣條件下，均可正常萌發(fā)。

1.1.2 種子的貯藏年限 隨著貯藏年限的延長(zhǎng)，種子分化營(yíng)養(yǎng)胚的時(shí)間相應(yīng)延長(zhǎng)，且數(shù)量少，質(zhì)量差，成苗率降低；隨著貯藏年限增加，種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)降低，營(yíng)養(yǎng)胚分化效果的差異是由于種子的活力發(fā)生變化所致（王果萍 等，1998）。王果萍（2002）采用不同貯藏年限的種子對(duì)西瓜子葉進(jìn)行離體培養(yǎng)，結(jié)果表明：成熟子葉誘導(dǎo)營(yíng)養(yǎng)胚芽叢分化試驗(yàn)采用貯藏1～2 a的種子，不僅發(fā)芽率高，發(fā)芽勢(shì)強(qiáng)，而且所需培養(yǎng)時(shí)間短，芽叢分化率及成苗率高。

1.1.3 外植體苗齡 外植體的生理年齡也是決定離體培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一。馬國(guó)斌等（1998）研究認(rèn)為未成熟子葉和幼苗子葉是西瓜組織培養(yǎng)的適宜外植體（2d苗齡子葉的不定芽分化頻率最高），種子萌動(dòng)后只要種皮易于剝?nèi)?，子葉便于切割，就可以盡量縮短子葉外植體的苗齡；宋道軍等（2000）研究認(rèn)為3d左右苗齡的西瓜基端子葉最易于再生。張志忠等（2004）認(rèn)為苗齡對(duì)分化影響較大，但由于培養(yǎng)條件和基因型等差異導(dǎo)致不同品種的種子發(fā)育快慢不同，不宜以天數(shù)來(lái)確定苗齡，而以子葉顏色判斷可能更有效，無(wú)菌苗子葉淡綠色時(shí)不定芽誘導(dǎo)率最高，顏色發(fā)黃或已變?yōu)樯罹G色的子葉分化效果較差，這與Dong和Jia（1991）、黃學(xué)森等（1994）、任春梅等（2000a）及王果萍等（2002）的報(bào)道均是一致的。

1.1.4 外植體的部位和大小 萬(wàn)勇等（2002）的試驗(yàn)研究認(rèn)為帶完整子葉的頂芽誘導(dǎo)不定芽的效果最好。林友豪等（2003）的研究表明西瓜帶全子葉、帶半片子葉和不帶子葉上胚軸培養(yǎng)對(duì)不定芽的發(fā)生有影響，前二者形成的不定芽數(shù)顯著多于后者。王春霞等（1996）通過(guò)京欣1號(hào)西瓜子葉組織培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，芽的分化只發(fā)生在子葉基端外植體臨近下胚軸一側(cè)的傷口邊緣，而從相同子葉頂端切取的外植體則不能出芽，這與王果萍（2002）的試驗(yàn)結(jié)果基本上是一致的。而且，試驗(yàn)表明切碎的子葉由于傷口的增多、與培養(yǎng)基的緊密接觸而容易吸收養(yǎng)分，誘導(dǎo)時(shí)間短，誘導(dǎo)率也高。

1.2 最適培養(yǎng)基的制備

培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)，含不同成分的培養(yǎng)基對(duì)西瓜外植體的培養(yǎng)會(huì)產(chǎn)生不同的效果。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因西瓜植株的過(guò)程中，主要用到以下幾種培養(yǎng)基：播種培養(yǎng)基、預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)培養(yǎng)基、篩選培養(yǎng)基、伸長(zhǎng)培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，其中播種培養(yǎng)基一般為MS培養(yǎng)基。統(tǒng)計(jì)不同研究者在不同試驗(yàn)階段使用的培養(yǎng)基類型如表1所示。

由表1可知，孫玉宏等（2007）的試驗(yàn)中，BM3是由MS的無(wú)機(jī)成分+100mg·L-1肌醇+1mg·L-1硫胺素鹽酸鹽組成，且其培養(yǎng)基中均附含30g·L-1蔗糖、8g·L-1瓊脂、pH5.8～6.0。

表1 不同試驗(yàn)階段使用的培養(yǎng)基類型

綜合不同學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)：各位學(xué)者在其試驗(yàn)中均可得到不同轉(zhuǎn)化率的西瓜轉(zhuǎn)基因再生植株。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的西瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究中，農(nóng)桿菌侵染前，需要將外植體置于含有外源激素的培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)，這樣可以提高遺傳轉(zhuǎn)化效率。另外，在培養(yǎng)過(guò)程中，必須在篩選培養(yǎng)基中添加抗生素以抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)。如羧芐青霉素（Cb）、卡那霉素（Kan）、頭孢霉素（Cef）等。在伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上要加入激動(dòng)素（KT）、6-芐胺基嘌呤（6-BA）等細(xì)胞分裂素以促進(jìn)不定芽的形成，增加繁殖系數(shù)。在生根培養(yǎng)基上需要加入 IAA、IBA、NAA等生長(zhǎng)素類物質(zhì)，以誘導(dǎo)根的生成。

2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的西瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究

2.1 抗生素對(duì)外植體的影響

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的培養(yǎng)轉(zhuǎn)化過(guò)程中，一個(gè)很重要的環(huán)節(jié)是抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，防止農(nóng)桿菌過(guò)度增殖對(duì)植物組織細(xì)胞造成傷害和影響植株的再生，這就需要用抗生素（又稱為抑菌性抗生素）及時(shí)有效地抑制，要求使用的抗生素在不傷害或少傷害受體材料的同時(shí)能完全抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)。

張志忠等（2005a）的試驗(yàn)表明，西瓜子葉塊外植體對(duì)潮霉素（Hyg）較為敏感，15mg·L-1是適宜的篩選濃度，可明顯抑制非轉(zhuǎn)化組織的生長(zhǎng)；卡那霉素（Kan）會(huì)加重外植體玻璃化，不適于西瓜不定芽的篩選；脫菌過(guò)程中，采用500mg·L-1的頭孢霉素（Cef），對(duì)外植體生長(zhǎng)影響較小；高濃度的羧芐青霉素（Cb）會(huì)使部分外植體發(fā)生水漬狀現(xiàn)象。張明方等（2006）的研究表明，西瓜子葉外植體在Kan濃度0～125mg·L-1的濃度梯度中，芽再生率隨著Kan濃度升高而降低，達(dá)到125mg·L-1時(shí)，芽再生困難。而在孫玉宏等（2007）的試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，125mg·L-1的Kan和300mg·L-1的Cb適合于外植體篩選培養(yǎng)。李文蘭等（2007a）的研究結(jié)果表明，氨芐青霉素、羧芐青霉素、頭孢霉素3種抗生素濃度低于600mg·L-1對(duì)西瓜子葉芽分化沒(méi)有明顯的影響，600mg·L-1以上對(duì)西瓜子葉芽分化產(chǎn)生明顯的抑制作用。3種抗生素中，西瓜子葉對(duì)頭孢霉素的耐受性更好一些，濃度為250mg·L-1的頭孢霉素有良好的抑制效果；確定潮霉素更適合西瓜轉(zhuǎn)基因的選擇劑，低濃度潮霉素已嚴(yán)重抑制根和芽的發(fā)生，20mg·L-1的潮霉素為不定芽分化適宜的篩選濃度，6mg·L-1的潮霉素即可抑制根的分化。

2.2 農(nóng)桿菌菌株類型對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

農(nóng)桿菌菌株直接影響轉(zhuǎn)化效率，不同的農(nóng)桿菌菌株有不同的宿主范圍，并有其特異侵染的最適宿主。不同類型的農(nóng)桿菌菌株的侵染力不同。一般而言，農(nóng)桿菌菌株侵染力的順序?yàn)椋恨r(nóng)桿堿型（琥珀堿型）菌株（A281）＞胭脂堿型菌株（C58）＞章魚堿型菌株（Ach5、LBA4404）。選擇受體植物敏感的菌株是成功轉(zhuǎn)化的重要因素，對(duì)同一植物而言，不同菌株的敏感性也不同（薛建平 等，2008）。有研究者曾對(duì)不同農(nóng)桿菌菌株的轉(zhuǎn)化效果進(jìn)行過(guò)比較，其中指出西瓜轉(zhuǎn)化中的最佳農(nóng)桿菌菌株為A208SE，其效果優(yōu)于GV3111SE和EHA101（王關(guān)林和方宏筠，1998b）。各位學(xué)者的研究不盡相同，而張志忠等（2005a）的研究表明，對(duì)西瓜而言，農(nóng)桿菌菌株EHA105的侵染能力明顯優(yōu)于LBA4404和AGL-1，其最高轉(zhuǎn)化率可達(dá)76.7 %。

2.3 農(nóng)桿菌菌液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

農(nóng)桿菌的活力狀態(tài)與其侵染活力有很大關(guān)系，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的農(nóng)桿菌的活力最強(qiáng)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期農(nóng)桿菌濃度一般在0.3～1.8 OD范圍（1.0 OD≈1×109cell·mL-1）。適宜的農(nóng)桿菌菌液濃度是影響轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素之一。濃度過(guò)低，農(nóng)桿菌數(shù)不足而影響侵染效率；濃度過(guò)高，農(nóng)桿菌過(guò)度繁殖又會(huì)對(duì)外植體造成傷害，從而降低轉(zhuǎn)化效率。李建勇等（2007）的研究表明，農(nóng)桿菌菌液OD600值為0.3左右時(shí)，其侵染效率最高，這與張志忠等（2005b）和孫玉宏等（2007）的研究結(jié)果是一致的。

2.4 侵染時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

農(nóng)桿菌對(duì)外植體的侵染時(shí)間是遺傳轉(zhuǎn)化中的重要因素。適宜的侵染時(shí)間可以使較多的農(nóng)桿菌附著于外植體傷口處；但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，外植體在后期培養(yǎng)中產(chǎn)生褐化死亡。一般以重新懸浮后的OD600值為0.3左右的菌液侵染外植體，確定侵染的最佳時(shí)間。張志忠等（2005b）的研究顯示，10min是比較適合西瓜子葉侵染的時(shí)間，這一結(jié)果與李建勇等（2007）、李文蘭等（2007b）、孫玉宏等（2007）的試驗(yàn)結(jié)果是一致的。

2.5 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

外植體在用農(nóng)桿菌侵染前，一般要在含有外源激素的培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的預(yù)培養(yǎng)，以刺激外植體細(xì)胞進(jìn)行脫分化細(xì)胞分裂，而處于分裂狀態(tài)的細(xì)胞可能易于感受和整合外源基因，使轉(zhuǎn)化率提高。因此，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間是影響植物轉(zhuǎn)基因效率高低的重要因素之一。如果外植體不經(jīng)預(yù)培養(yǎng)或預(yù)培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短，在被農(nóng)桿菌侵染后子葉傷口容易褐化，并且在篩選分化芽時(shí)會(huì)造成農(nóng)桿菌大量繁殖，使子葉死亡。預(yù)培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，外植體的傷口處于愈合和封閉狀態(tài)，也不利于農(nóng)桿菌的侵染。李建勇等（2007）的試驗(yàn)結(jié)果表明預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為2d時(shí)，西瓜子葉轉(zhuǎn)化效率最高。

2.6 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

研究表明，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化時(shí)，并不“侵入”到植物細(xì)胞中去，而是把T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞。農(nóng)桿菌附著后不能立即轉(zhuǎn)化，只有在創(chuàng)傷部位生存16 h之后的菌株才能誘發(fā)腫瘤，這一段時(shí)間稱為細(xì)胞調(diào)節(jié)期。因此，共培養(yǎng)時(shí)間必須長(zhǎng)于16 h（王關(guān)林和方宏筠，1998a）。共培養(yǎng)是農(nóng)桿菌入侵子葉傷口細(xì)胞實(shí)現(xiàn)目的基因轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。在理論上，農(nóng)桿菌與植物共培養(yǎng)的時(shí)間越長(zhǎng)，受侵染的細(xì)胞越多，目的基因的轉(zhuǎn)化頻率也就越高。但是在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)的時(shí)間太長(zhǎng)，農(nóng)桿菌過(guò)度增殖，子葉會(huì)受農(nóng)桿菌過(guò)度感染變褐而死亡，達(dá)不到轉(zhuǎn)化效果；共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短，T-DNA轉(zhuǎn)移過(guò)程不能完成。因此共培養(yǎng)時(shí)間太長(zhǎng)或太短都不利于目的基因的轉(zhuǎn)化，確定合適的共培養(yǎng)時(shí)間是提高轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵因素之一。李建勇等（2007）在研究中發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)時(shí)間為3d時(shí)外植體轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高，4d時(shí)轉(zhuǎn)化效率開始下降，這與張志忠等（2005b）的試驗(yàn)結(jié)果相同。

2.7 乙酰丁香酮對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

Vir區(qū)基因的活化是農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的先決條件。酚類化合物、單糖或糖酸、氨基酸、磷酸饑餓和低 pH都影響 Vir區(qū)基因的活化。在轉(zhuǎn)基因操作過(guò)程中，最常用的誘導(dǎo)物是乙酰丁香酮（AS）和羥基乙酰丁香酮（HO-AS），但AS效果更佳。關(guān)于誘導(dǎo)劑的使用有3種方法：① 在農(nóng)桿菌菌液培養(yǎng)時(shí)一般是制備工程菌侵染液4～6 h前加入誘導(dǎo)劑，也有在農(nóng)桿菌制成侵染液時(shí)加入；② 誘導(dǎo)劑加在共培養(yǎng)基中；③ 在農(nóng)桿菌液體培養(yǎng)基和共培養(yǎng)基中都加入誘導(dǎo)劑。AS的使用濃度一般為5～200μmol·L-1，培養(yǎng)基的 pH值為5.1～5.7，共培養(yǎng)溫度為15～25℃，D-半乳糖酸為100μmol·L-1，葡萄糖酸為10mmol·L-1，葡萄糖為10mmol·L-1，磷酸根濃度為0～0.1mmol·L-1（薛建平 等，2008）。張志忠等（2005b）的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加20mg·L-1乙酰丁香酮可顯著提高西瓜子葉外植體的轉(zhuǎn)化效率，最高可達(dá)74.8 %。這與一些相關(guān)研究者的試驗(yàn)結(jié)果是一致的（Ellul et al.，2003；Akashi et al.，2005；李建勇 等，2007）。

3 問(wèn)題與展望

3.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的西瓜遺傳轉(zhuǎn)化存在的問(wèn)題

西瓜被認(rèn)為是很難利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)取得成功轉(zhuǎn)化的物種，這可能是與物種的特異性有關(guān)，對(duì)農(nóng)桿菌的敏感性、再生能力、芽的分化方式等因素都是轉(zhuǎn)基因取得成功的關(guān)鍵限制因素。科研工作者一直在嘗試用植物基因工程的方法來(lái)培育優(yōu)良的西瓜品種（Dong & Jia，1991）。但是，許多研究表明由于西瓜再生能力較弱，且再生植株存在較為嚴(yán)重的玻璃化現(xiàn)象，而這種情況幾乎無(wú)法避免（Thomas et al.，2000），并且西瓜再生植株難以直接移栽成活，移栽過(guò)程中死苗率很高（任春梅和董延瑜，2000a），是世界公認(rèn)的較難用農(nóng)桿菌成功轉(zhuǎn)化的植物之一（王春霞 等，1996）。因此，進(jìn)行西瓜的遺傳轉(zhuǎn)化工作較為困難。

3.2 展望

與其他方法比較，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)便、不需特殊的儀器、培養(yǎng)周期較短等特點(diǎn)，更重要的是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入的基因經(jīng)常是單拷貝，因而表達(dá)水平高，并且可以轉(zhuǎn)入大的dNA片段（王關(guān)林和方宏筠，1998b），因此對(duì)于大多數(shù)植物的轉(zhuǎn)化工作而言是首先考慮的方法，對(duì)其在西瓜中的應(yīng)用研究是有益的且是必要的。目前農(nóng)桿菌介導(dǎo)法已應(yīng)用于西瓜遺傳轉(zhuǎn)化的研究，并建立了西瓜子葉農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷完善和外源基因的不斷挖掘，必將在西瓜性狀改良和新品種培育上發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。因此，利用分子克隆技術(shù)提取分離或人工合成具有某一特性的基因，如改良西瓜品質(zhì)基因，西瓜抗蟲、抗病或抗逆性基因以及西瓜雄性不育基因等，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或基因槍法等，將這些基因?qū)胛鞴希梢垣@得利用常規(guī)育種難以得到的新種質(zhì)，為西瓜育種開辟新的途徑。

在進(jìn)一步完善西瓜抗病品種培育的同時(shí)，其他抗逆、品質(zhì)改良、控制生長(zhǎng)發(fā)育等基因工程有待大大加強(qiáng)。近幾年中、小果型西瓜在我國(guó)特別流行，尤其是迷你型袖珍西瓜。這些西瓜品種中普遍存在的問(wèn)題則是皮薄、易裂果、不耐貯運(yùn)。若能把ACC氧化酶及其反義基因?qū)胛鞴?，培育耐貯運(yùn)的西瓜品種，便可使該問(wèn)題得到解決。

另外，隨著植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的不斷成熟，利用植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白的研究受到較高的重視，研究探索的熱點(diǎn)之一是利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)口服疫苗，我國(guó)科研人員將乙型肝炎病毒表面抗原基因?qū)腭R鈴薯和番茄，因此，如果能夠?qū)⑦@些基因?qū)氲胶线m的西瓜品種中（如小果型西瓜），將大大提高西瓜的附加值（艾呈祥和劉志昕，2004）。

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Research Progress on Agrobacterium tumefaciensmediatedgenetic Transformation of Watermelon

LI Juan1，LI Wan-ning2，TANG Yi1，LI Huan-xiu1*
（1College of Horticulture，Sichuan Agricultural University，Ya’an625014，Sichuan，China；2Ruraldevelopment Bureau of Shuangliu County，Shuangliu610200，Sichuan，China）

The paper introduces the present status of studies on Agrobacterium tumefaciensmediatedgenetic transformation of watermelon〔Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum. et Nakai〕，summarizes themajor influencing factors in establishing efficient regeneration system of watermelon andgenetic transformation process.The best selection of explants，the optimalmedium preparation，and antibiotics，types of Agrobacterium tumefaciens，concentration of bacteria，infecting time，pre-culture time，culture time and add acetyl clove ketone，etc are summed up.The paper alsodiscusses issues existing in watermelongenetic transformation and prospects the futuredevelopment of this system.

Watermelon；Genetic transformation；Agrobacterium tumefaciens；Review

S651

A

1000-6346（2010）08-0007-07

2009-10-21；接受日期：2009-12-31

國(guó)家科技部課題（2008BAD51BO2）

李娟，碩士研究生，專業(yè)方向：蔬菜學(xué)，E-mail：klnhlj@163.com

* 通訊作者（Corresponding author）：李煥秀，教授，博士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：蔬菜學(xué)，E-mail：hxli@sicau.edu.cn