卜淑敏，陳永杰，郝利科，王穎捷

(首都體育學(xué)院，北京 100088)

研究報(bào)告

中等強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)預(yù)防去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松

卜淑敏，陳永杰，郝利科，王穎捷

(首都體育學(xué)院，北京 100088)

目的觀察中等強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的預(yù)防作用。方法將30只3月齡未經(jīng)產(chǎn)雌性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)、去卵巢靜止和去卵巢運(yùn)動(dòng)三個(gè)組。去卵巢運(yùn)動(dòng)組每周進(jìn)行4次時(shí)間45 min、速度18 m/min、坡度5°的跑臺(tái)訓(xùn)練。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，檢測血清雌二醇(E2)、堿性磷酸酶(ALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和骨鈣素(BGP)水平以及右側(cè)游離股骨和脛骨的骨密度(BMD)和骨礦物含量(BMC);同時(shí)觀察左側(cè)股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果與假手術(shù)組比較，去卵巢靜止組大鼠血清ALP活性和BGP含量顯著升高，血清TRAP活性和E2含量顯著下降，股骨近段和遠(yuǎn)端以及脛骨近端BMD和BMC顯著下降，股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端骨小梁斷裂增加、數(shù)目減少;與去卵巢靜止組比較，去卵巢運(yùn)動(dòng)組大鼠血清E2和BGP含量顯著上升，股骨三個(gè)部位以及脛骨近端BMD和BMC顯著增加，股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端骨小梁斷裂減少、數(shù)目增加。結(jié)論中等強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)能增加去卵巢大鼠血清E2和BGP含量，改善去卵巢大鼠骨組織學(xué)結(jié)構(gòu)。

去卵巢大鼠;運(yùn)動(dòng);骨密度;骨礦物含量，骨形態(tài)學(xué)

女性進(jìn)入絕經(jīng)期后，由于卵巢功能逐漸衰竭，體內(nèi)雌激素(estrogen，E2)水平下降，骨生成和骨吸收代謝失衡，及易導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生［1］，目前尚無安全有效的根治辦法，因而早期預(yù)防顯得比較重要。在骨質(zhì)疏松的預(yù)防方法中，運(yùn)動(dòng)療法以其方便、成本低、副作用少等優(yōu)點(diǎn)日益受到醫(yī)務(wù)人員和患者的青睞。運(yùn)動(dòng)能調(diào)節(jié)骨量已為人們所熟知［3］，然而關(guān)于力學(xué)刺激是如何被轉(zhuǎn)換成骨細(xì)胞感知的生物學(xué)效應(yīng)目前還知之甚少。切除動(dòng)物雙側(cè)卵巢是目前國內(nèi)外通用的復(fù)制婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的經(jīng)典方法［2］，鑒此，本實(shí)驗(yàn)采用我們前期建立的去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型［4］，參考我們前期相關(guān)去卵巢大鼠研究的工作［5］，觀察了中等強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對去卵巢大鼠部分血清骨轉(zhuǎn)換相關(guān)指標(biāo)、骨量相關(guān)指標(biāo)、骨形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響，旨在為進(jìn)一步探討運(yùn)動(dòng)防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的細(xì)胞分子機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

血清堿性磷酸酶(ALP)和抗酒石酸性磷酸酶(TRAP)購自南京建成生物工程有限公司;血清雌二醇放射免疫藥盒購自中國原子能科學(xué)研究所;血清骨鈣素(BGP)ELISA試劑盒購自美國ADL公司。DSPT－202小動(dòng)物跑臺(tái)為杭州段氏制造廠生產(chǎn); Thermo Multiskan MK3酶標(biāo)儀為芬蘭雷勃;Olympus BX51顯微鏡為日本產(chǎn);Leica軟組織切片機(jī)為德國產(chǎn);XR－36雙能 x射線骨密度儀為美國 Norland公司產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物手術(shù)和分組

健康3月齡雌性未經(jīng)產(chǎn) SD大鼠30只，體重(230±8)g，購自并在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部飼養(yǎng)(動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(京)2006－0008)。適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組(10只)和手術(shù)組(20只)。手術(shù)前大鼠禁食12 h，按體重腹腔注射10%水合氯醛(1 mL/kg)麻醉，手術(shù)組從背部切除雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組不切除卵巢，只切除卵巢旁與卵巢等大的脂肪組織。術(shù)后1周按體重又將手術(shù)組大鼠隨機(jī)分為去卵巢靜止組和去卵巢運(yùn)動(dòng)組，每組10只。有3只大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中先后死亡，最后納入實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物數(shù)見表1。

1.3 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案

跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案參考我們以前報(bào)道并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整［5］。手術(shù)1周后，去卵巢運(yùn)動(dòng)組大鼠開始在小動(dòng)物跑臺(tái)上適應(yīng)訓(xùn)練 1周，然后進(jìn)行 18 m/ mim，45 min，坡度5°的正式跑臺(tái)訓(xùn)練，每周4次，正式訓(xùn)練14周。每周一上午稱所有大鼠體重一次。

1.4 取材

最后一次運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練24 h后，按體重腹腔注射水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血后，游離子宮并在萬分之一天平上稱重，游離雙后肢股骨和脛骨，去盡周圍結(jié)締組織，，將左側(cè)股骨和脛骨濕紗布包裹后－20℃凍存，而將右側(cè)后肢股骨和脛骨用4%多聚甲醛溶液固定，脫鈣后常規(guī)石蠟包埋。

1.5 血清E2和骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)測定

血清E2采用放射免疫方法測定，BGP采用酶標(biāo)儀測定，TRAP和ALP采用全自動(dòng)生化分析儀測定，實(shí)驗(yàn)操作完全按照試劑盒說明書。

1.6 骨密度測定

采用雙能x射線骨密度儀的小動(dòng)物軟件系統(tǒng)分別測量股骨和脛骨近端、中段和遠(yuǎn)端三部位骨密度(BMD)和骨礦物含量(BMC)。

1.7 骨組織石蠟切片和HE染色

每組隨機(jī)取3只大鼠的股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端，切取5 μm連續(xù)切片。隨機(jī)取每只大鼠的3張切片經(jīng)常規(guī)HE染色，在顯微鏡下觀察拍片。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間差異顯著性采用方差分析的LSD(ANOVA one－way)，P＜0.05被認(rèn)為差異有顯著性，P ＜0.01被認(rèn)為差異有極顯著性。

2 結(jié)果

2.1 去卵巢手術(shù)相關(guān)指標(biāo)

由表1可知，與假手術(shù)組比較，去卵巢靜止組大鼠血清E2水平和子宮指數(shù)顯著下降;與去卵巢靜止組比較，去卵巢運(yùn)動(dòng)組大鼠血清 E2水平顯著增加，而子宮指數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2 血清骨轉(zhuǎn)換相關(guān)指標(biāo)

由表2可知，與假手術(shù)組比較，去卵巢靜止組大鼠血清ALP和BGP水平顯著增加，TRAP水平顯著下降;與去卵巢靜止組比較，去卵巢運(yùn)動(dòng)組大鼠血清BGP水平顯著增加，ALP和TRAP水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3 骨量相關(guān)指標(biāo)

由表3可知，與假手術(shù)組比較，去卵巢靜止組大鼠股骨近端和遠(yuǎn)端的BMD與BMC顯著下降，中段無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;與去卵巢靜止組比較，去卵巢運(yùn)動(dòng)組股骨各段的BMD與BMC均顯著增加。

表1 各組大鼠血清E2水平和子宮指數(shù)的比較Tab.1 Comparison of estrogen content and uterus index in the 3 groups OF RATS

表2 各組大鼠血清骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)的比較Tab.2 Comparison of bone transformation markers in the 3 groups of rats

表3 各組大鼠股骨骨密度和骨礦物含量的比較Tab.3 Comparison of femur BMD and BMC in all groups of rats

表4 各組大鼠脛骨骨密度和骨礦物含量比較Tab.4 Comparison of tibia BMD and BMC in the 3 groups of rats

由表4可知，與假手術(shù)組比較，去卵巢靜止組大鼠脛骨近端的BMD和BMC顯著下降，中段和遠(yuǎn)端無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;與去卵巢靜止組比較，去卵巢運(yùn)動(dòng)組大鼠脛骨近端的BMD和BMC顯著增加，中段和遠(yuǎn)端無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.4 骨形態(tài)學(xué)相關(guān)指標(biāo)

由圖1(見彩插1)可知，假手術(shù)組股骨遠(yuǎn)端(A)和脛骨近端(B)骨小梁排列完整且緊密，骨髓中有少量的脂肪空泡;去卵巢靜止組股骨遠(yuǎn)端(C)和脛骨近端(D)骨小梁斷裂，骨髓中充滿脂肪空泡;去卵巢運(yùn)動(dòng)組股骨遠(yuǎn)端(E)和脛骨近端(F)骨小梁數(shù)目多于去卵巢組，但仍有斷裂，脂肪空泡數(shù)目少于去卵巢靜止組。

3 討論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的病因復(fù)雜，雖然目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為婦女絕經(jīng)后 E2水平下降，骨轉(zhuǎn)換加快，骨吸收大于骨形成是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的主要病因，但其發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚［6］。在骨質(zhì)疏松的臨床研究中，動(dòng)物模型的研究不僅可以從組織和細(xì)胞水平提供藥物作用機(jī)制，還可以從組織和細(xì)胞水平評(píng)價(jià)藥物的療效。1969年 Saville首次用去卵巢大鼠建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型［7］，后此模型被反復(fù)證實(shí)能很好地模擬婦女由于絕經(jīng)引起的骨質(zhì)疏松臨床癥狀［2，8］。本實(shí)驗(yàn)中，與假手術(shù)組比較，去卵巢靜止組大鼠子宮指數(shù)、血清E2水平、股骨近端和遠(yuǎn)端以及脛骨近端的BMD和BMC均顯著下降，股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端骨小梁數(shù)目減少、間距增大、斷裂增加。不僅表明本實(shí)驗(yàn)的手術(shù)成功而且表明絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型也成功復(fù)制。

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松是可以預(yù)防的，而且臨床實(shí)踐證明絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的預(yù)防比治療更重要［3］。眾所周知，運(yùn)動(dòng)是一種方便易行的預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的康復(fù)手段。但運(yùn)動(dòng)對骨量的調(diào)節(jié)不僅與運(yùn)動(dòng)的方式、頻率、強(qiáng)度有關(guān)，而且與運(yùn)動(dòng)者的年齡和性別有關(guān)［3］。在運(yùn)動(dòng)對去卵巢大鼠骨骼影響的研究中，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)是最為常用的運(yùn)動(dòng)方式，相關(guān)不同強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對去卵巢大鼠骨影響的研究已表明，中等強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)能改善去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松狀態(tài)，而持續(xù)大強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對骨量的丟失沒有抑制作用［9－11］。本實(shí)驗(yàn)中，去卵巢大鼠經(jīng) 14周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)處理后，股骨和脛骨的BMC和BMD均顯著增加，說明本實(shí)驗(yàn)采用的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷比較合適。為了進(jìn)一步確定本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷對去卵巢大鼠的療效，我們觀察了運(yùn)動(dòng)對去卵巢大鼠股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端組織形態(tài)學(xué)的影響。結(jié)果表明，去卵巢運(yùn)動(dòng)組骨小梁數(shù)目多于去卵巢靜止組，骨髓腔中脂肪空泡數(shù)目少于去卵巢靜止組，表明本實(shí)驗(yàn)采用的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷能有效改善去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥狀。

在評(píng)價(jià)各種藥物或理療方法對骨質(zhì)疏松的療效時(shí)，測定血清骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)是一種簡便而又不對患者造成傷害的檢測手段之一。TRAP是常用的反映骨吸收的指標(biāo)，而ALP和BGP是常用的反映骨形成的指標(biāo)［12］。就我們查閱文獻(xiàn)所知，目前有關(guān)去卵巢后血清 TRAP、ALP和BGP的研究結(jié)果報(bào)道不一。有結(jié)果表明，大鼠去卵巢后，TRAP、ALP和BGP水平均顯著增加;而也有結(jié)果表明，大鼠去卵巢后，TRAP、ALP和 BGP水平呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢［13－16］。本實(shí)驗(yàn)中，大鼠去卵巢 16周時(shí)，血清TRAP活性顯著下降，而ALP活性和BGP含量顯著升高。提示，在去卵巢的晚期(3個(gè)月以上)，破骨細(xì)胞活動(dòng)減弱，成骨細(xì)胞活動(dòng)相對較強(qiáng)，骨吸收處于低水平，骨丟失相對平緩。此時(shí)單純使用抑制骨吸收的藥物可能對改善骨質(zhì)疏松的癥狀作用不大，而能促進(jìn)骨形成的藥物可能有更好的抗骨質(zhì)疏松作用。

一般認(rèn)為隨著骨吸收亢進(jìn)而出現(xiàn)的代償性骨形成增強(qiáng)可引起血清成骨生化指標(biāo)升高，所以以抑制破骨治療為主時(shí)血清成骨生化指標(biāo)下降，而采用促進(jìn)成骨法治療時(shí)血清骨形成指標(biāo)升高。Sakakura等人報(bào)道［11］，8周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)能顯著增加去卵巢大鼠血清ALP活性，降低TRAP活性。本實(shí)驗(yàn)中，14周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對去卵巢大鼠血清 ALP和TRAP活性沒有影響，但能顯著增加血清BGP含量，提示運(yùn)動(dòng)對去卵巢大鼠血清骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)的影響可能與運(yùn)動(dòng)持續(xù)的時(shí)間有關(guān)。血清ALP主要來源于骨和肝臟，只有在排除了肝病和甲抗等疾病的情況下，血ALP才代表成骨細(xì)胞的活性［12］。BGP，又稱骨 Gla蛋白，屬非骨膠原蛋白中的一種，血 BGP來源于成骨性細(xì)胞譜系，主要由非增殖期成骨細(xì)胞分泌入血［12］，可見血清ALP可能沒有BGP特異，這可能是本實(shí)驗(yàn)中，中等強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對去卵巢大鼠晚期血清 ALP和BGP水平影響不一致的原因。

綜上，中等強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可能主要是通過增加血清E2和BGP水平，預(yù)防去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的發(fā)生。

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Preventive Effects of Moderate Treadmill Exercise on Osteoporosis in Ovariectomized Rats

BO Shu－min，CHEN Yong－jie，HAO Li－ke，WANG Ying－jie
(Capital Institute of Physical Education，Beijing 100088，China)

ObjectiveTo observe the effect of moderate－treadmill exercise on osteoporosis in ovariectomized (OVX)rats。MethodsThirty healthy 3－month old female SD rats were randomly divided into the following three groups: sham－operation(Sham)，orariectomized(OVX)and OVX exercise(EX)groups.The EX group rats did exercise four times per week for 14 weeks according to the following schedule:speed of 18 m/min，45 min time and slope grade of 5°. At the end of experiment，blood was collected from the abdominal vein under anesthesia.The level of serum estrogen (E2)，tartrate－resistant acid phosphatase(TRAP)，alkaline phosphates(ALP)，osteocalcin(BGP)，the femur and tibia bone mineral density(BMD)and bone mineral content(BMC)were detected whereas the morphological change of distal femur and proximal tibia were examined。ResultsThe serum levels of ALP and BGP in OVX group were significantly higher than that of the sham operation group.Compared with the sham operation group，the serum levels of TRAP and E2，the BMD and BMC of proximal and distal femur as well as proximal tibia in the OVX group were significantly decreased. Compared with the OVX group，the serum levels of E2and BGP，the BMD and BMC in three sites of the femur and the proximal tibia were significantly increased。Conclusions Treadmill exercise can increase the serum level of E2and BGP，and has improving effect on bone microstructure in orariectomized rats.

Ovariectomized rats;Exercise;Bone mineral density;Bone mineral content;Bone morphology

G804.7

A

1671－7856(2010)04－0014－05

2009－12－15

國家自然科學(xué)基金(30771046);北京市教委科技發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目(KM200710029001)。

卜淑敏(1967－)，女，博士，教授，研究方向:運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)。E－mail:boshumin.163.com。