梁 晨,葉海英,張玉榮,汪 蓉

(上海市公安局刑事科學技術研究管理中心,上海市現場物證重點實驗室,上海 200083)

吸毒者尿樣中3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡和可待因的LC-MS/MS分析

梁 晨,葉海英,張玉榮,汪 蓉

(上海市公安局刑事科學技術研究管理中心,上海市現場物證重點實驗室,上海 200083)

建立吸毒者尿樣中3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因的液相色譜-串聯質譜分析方法。尿樣經固相萃取后,用C18液相柱分離,以含甲酸銨和甲酸的水、乙腈為流動相等度洗脫,采用電噴霧電離(ESI+),多反應監(jiān)測(MRM)模式檢測目標化合物。以化合物的保留時間、2對母離子/子離子對定性,尿樣中3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡的檢測限為 0.5μg·L-1,嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因的檢測限為0.1μg·L-1;線性關系良好,相關系數 r在0.998以上;日內及日間精密度均在10%以內。該方法快速、靈敏、簡便、可靠,能同時分析吸毒者尿樣中的3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡和可待因。

液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS);3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡;嗎啡;O6-單乙酰嗎啡;可待因;固相萃取;尿樣

按照公安部《對吸食、注射毒品人員成癮標準界定》的規(guī)定,凡查獲吸食、注射毒品者,應進行毒癮司法鑒定和吸毒違法行為的認定,這兩個步驟的首位要素是對涉毒人員的尿液中毒品物質進行檢測。為保證檢測的客觀性、準確性和及時性,必須了解海洛因在體內的代謝過程。海洛因在體內代謝快,幾乎檢測不到原體,很快代謝為嗎啡和單乙酰嗎啡,代謝產物嗎啡與β-D-葡萄糖醛酸發(fā)生結合反應。生物檢材中嗎啡類生物堿的分析已有很多報道,但是檢材必須經過溶劑提取、衍生化等繁瑣步驟,難以滿足實際案件快速檢驗的需要[1]。近年來,液相色譜-質譜聯用(LC-MS/MS)技術發(fā)展迅速,它集液相色譜高效的在線分離能力與質譜的高靈敏度、高選擇性于一體,成為法醫(yī)毒物分析強有力的工具。與GC/MS相比,LC-MS/MS應用范圍更廣,不受被分析物揮發(fā)性、極性、熱穩(wěn)定性的限制,也無需衍生化過程。多反應監(jiān)測(MRM)模式通過2次離子選擇作用,鎖定目標物的母離子/子離子對,大大提高了分析的專一性和靈敏度。本工作建立的LC-MS/MS方法可同時分析吸毒者尿樣中3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡和可待因。

1 材料與方法

1.1 試劑

3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡、內標嗎啡-d3:購自Cerilliant公司;嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因:購自中國藥品生物制品檢定所。

乙腈、甲醇、甲酸、甲酸胺均為色譜純:購自Merck公司;其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器及條件

1.2.1 儀器 Waters Alliance 2695/Quattro Premier XE串聯四極桿液相色譜-質譜聯用儀:美國 Waters公司產品,配有 MassLynxV4.1軟件。

1.2.2 色譜條件 Xterra MS C18色譜柱(3.5 μm×2.1 mm×150 mm);流動相為A(含2 mmol·L-1甲酸銨和0.05%甲酸的水)∶B(含2 mmol·L-1甲酸銨和0.05%甲酸的乙腈)= 90∶10;柱溫45℃;流速0.2 mL·min-1;進樣量10μL。

1.2.3 質譜條件 多反應監(jiān)測模式,電噴霧電壓3 200 V,霧化氣(N2)流速600 L·h-1,錐孔反吹氣(N2)流速50 L·h-1,離子源溫度 105℃,碰撞氣為氬氣。

1.2.4 MRM參數 每個化合物選取2個子離子結合保留時間定性,選取峰強度較高的子離子進行定量分析,各參數列于表1。

表1 3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因及內標的質譜MRM參數Table 1 Mass spectrometric parameters of morphine-3-β-Dglucuronide, morphine,codeine,O6-monoacetylmorphine and morphine-d3

1.3 樣品處理方法

依次用 1 mL甲醇,1 mL水活化 Oasis HLB柱(1 mL/30 mg),精密吸取1.0 mL尿樣,加入100 ng內標,混勻后上柱,用1 mL含5%甲醇的水淋洗柱子,然后用1 mL甲醇洗脫,整個過程流速控制在2 mL·min-1左右。洗脫液在60℃水浴中空氣流下吹干,殘渣用100μL初始流動相溶解,轉移至自動進樣小瓶中,進樣。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因及內標在選定的液相色譜分析條件下,保留時間分別為 1.98、2.25、3.58、4.70和2.26 min,在8 min內完成分析,色譜行為良好,各化合物及內標的MRM色譜圖示于圖1。

2.2 最低檢測限

以峰強度較低的子離子峰強度信噪比S/N>5確定為最低檢測限(LOD)。

2.3 線性關系和精密度

分別取不同量的對照品混合液于具塞尖底試管中,吹干后加入1.0 mL空白尿樣,配成系列濃度的樣品,按1.3操作。以峰面積與內標峰面積之比(y)對樣品中化合物的濃度(x)作圖,得到回歸方程和相關系數,各化合物線性關系良好,線性方程列于表2。高、中、低濃度日內重復測定6次得日內精密度,連續(xù)測定3天得日間精密度,列于表3。

表2 3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因的檢測限和線性關系Table 2 The limit of detection,linear equation and coefficient of morphine-3-β-D-glucuronide, morphine,O6-monoacetylmorphine and codeine

2.4 案例應用

本方法應用于一起實際案件的吸毒者尿樣分析,尿中檢出3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因成分,其含量分別為2.603、0.044、0.331、0.531 mg·L-1。

圖1 3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因及內標的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of morphine-3-β-D-glucuronide,morphine,O6-monoacetylmorphine, codeine and morphine-d3

表3 3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因的日內及日間精密度Table 3 Intra-and inter-day precision of morphine-3-β-D-glucuronide, morphine,O6-monoacetylmorphine and codeine

3 討 論

在吸食或注射海洛因,特別是其導致死亡的案件中,毒品的定性定量檢驗是判斷是否吸食此類毒品的直接依據。海洛因進入體內后,很快被血脂酶去乙酰化成O6-單乙酰嗎啡,再進一步代謝成去甲嗎啡和嗎啡。嗎啡的主要代謝途徑是3位羥基與葡萄糖醛酸結合,87%的嗎啡72 h內代謝掉,而其中75%為3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡形式[2]。本工作建立的尿樣中,3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡和可待因4種成分的分析方法,可用于判斷可疑者是否吸食海洛因。

3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡是嗎啡的主要代謝形式,由于水溶性強、極性大,提取、檢測都比較困難,國內文獻未見有關分析方法報道。常用的嗎啡類生物堿提取溶劑 V(氯仿)∶V(異丙醇)=9∶1的提取效果不佳,通過比較, SPE的效果比較滿意。國外文獻報道有嗎啡類生物堿及其葡萄糖醛酸結合物的分析方法[3-5],但SPE結合LC-MS/MS同時分析尿樣中3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡和可待因的方法還未見報道。

[1]向 平,沈 敏,沈保華,等.生物檢材中嗎啡類生物堿的LC-MS/MS分析[J],法醫(yī)學雜志,2006, 22(1):52-54.

[2]呂海茹.尿中嗎啡常見檢測方法[J].刑事技術, 2008,(2):29-31.

[3]ARY K,RONA K.LC determination of morphine and morphine glucuronides in human plasma by coulometric and UV detection[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2001,26(2): 179-187.

[4]EDWARDS S R,SMITH M T.Simultaneous determination of morphine,oxycodone,morphine-3-glucuronide,and noroxycodone concentrations in rat serum by highperformance liquid chromatographic-electrospray ionization-tandem mass spectrometry[J].Chromatogr,2005,814:241-249.

[5]PROJ EAN D,TU M,DUCHARMEJ.Rapid and simple method to determine morphine and its metabolites in rat plasma by liquid chromatographymass spectrometry[J].Journal of Chromatography B,2003,796(1):95-103.

Determination of Morphine-3-β-D-Glucuronide,Morphine, O6-Monoacetylmorphine and Codeine in Heroin Addicts’Urine by LC-MS/MS

LIANG Chen,YE Hai-ying,ZHANG Yu-rong,WANG Rong
(Shanghai Key L aboratory of Crime Scene Evidence,Shanghai Institute of Forensic Science,Shanghai200083,China)

Morphine-3-β-D-glucuronide,morphine,codeine andO6-monoacetylmorphine in heroin addicts’urine samples were analyzed by liquid chromatography-tandem mass spectrum(LC-MS/MS).The urine samples were extracted by solid phase extraction(SPE),isolated by the C18column and then analyzed by MS.The positive electric spray ionization mode was applied,multiple reaction monitoring(MRM)mode was used to analyze target compounds.Identification was based on retention time and two pairs of precursor-to-product ion transitions.The limit of detection(LOD)is 0.1μg·L-1for morphine,codeine,O6-monoacetylmorphine and 0.5μg·L-1for morphine-3-β-D-glucuronide,the relative standard deviation of intra-and inter-day precision are less than 10%.The method shows high sensitivity and selectivity,and is suitable for the analysis of morphine-3-β-D-glucuronide, morphine,codeine,O6-monoacetylmorphine in heroin addicts’urine samples.

liquid chromatography-tandem mass spectrum(LC-MS/MS);morphine-3-β-D-glucuronide;morphine;codeine;O6-monoacetylmorphine;solid phase extraction;urine

O 657.63

A

1004-2997(2010)04-0224-04

2009-12-18;

2010-03-26

梁 晨(1978～),女(漢族),河北人,主檢法醫(yī)師,從事毒物、毒品分析研究。E-mail:morning_liangch@sohu.com

張玉榮(1962～),男(漢族),福建人,主任法醫(yī)師,從事毒品、毒物分析研究。E-mail:yr_zhang@126.com