寧方勇，王 星，杜智恒，楊春山，白秀娟

（1.東北農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.遼東學院農(nóng)學院，遼寧 丹東 118003）

哺乳動物核移植研究進展

寧方勇1，王 星2，杜智恒1，楊春山1，白秀娟1

（1.東北農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.遼東學院農(nóng)學院，遼寧 丹東 118003）

哺乳動物核移植（Nuclear Transplantation，NT）是目前生物技術領域研究的熱點之一，其科學意義和應用價值重大。本文根據(jù)近年來國內(nèi)外的研究進展，對核移植技術步驟、核移植研究概況及目前核移植研究中存在的問題作一綜述，希望能夠?qū)氖潞艘浦惭芯康耐杏兴鶐椭?/p>

哺乳動物；核移植；研究進展

哺乳動物核移植就是人們通常所說的動物克隆，是指通過顯微操作的方法，從早期胚胎分離一個卵裂球或分離一個培養(yǎng)的體細胞，通過顯微操作儀將其注入到去核卵母細胞的胞質(zhì)或透明帶下，重新組建一個新的胚胎。這個胚胎稱為重組胚或克隆胚?？寺∨弑患せ詈螅w細胞DNA可以像正常受精卵一樣，經(jīng)細胞分裂，分化并在母體內(nèi)發(fā)育成一個新的個體[1]。新個體具有與供體完全相同的基因型，即新個體具有與供體完全相同的遺傳物質(zhì)。因此，核移植技術在動物育種、制備轉(zhuǎn)基因動物、基因治療和器官移植等方面具有重大作用[2]。哺乳動物核移植技術可以根據(jù)供核細胞的不同分為胚細胞核移植和體細胞核移植兩類。

1 哺乳動物核移植的主要步驟

哺乳動物核移植技術包括一系列復雜程序：供體細胞的選擇與體外培養(yǎng)、卵母細胞的體外成熟及激活、去核、細胞核移植、融合-激活、重構(gòu)胚的體外培養(yǎng)和胚胎移植。

1.1 供體細胞的選擇與體外培養(yǎng)

用于核移植的細胞有多種，最早采用早期胚胎的卵裂球，在1997年Wilmut等報道“多莉”羊之前主要是以此類細胞作為供核。這些細胞具有全能性或多能性，相對來說核移植的成功率高[3]。目前用于核供體的主要有卵丘細胞、睪丸支持細胞、精子細胞、腦細胞、胎兒或成體成纖維細胞、胚胎干細胞（ES細胞）等[4]。供體與受體細胞的細胞周期發(fā)育同步化是影響核移植成敗的一個重要因素，早期的研究認為供體細胞處于G0期[5]是體細胞核移植成功所必需的，并指出可通過選擇細胞類型或人工誘導兩種方法來獲得G0期細胞。然而近來發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)休眠誘導的G1或G2甚至M期供體細胞的核移植也均獲得了成功[6]。與此同時，研究還發(fā)現(xiàn)在小鼠的核移植中供體細胞的類型和基因型對移植效率也有較大影響[7]。

從目前的研究來看，似乎應用處于各個細胞時相的細胞都能得到克隆動物，但還沒有一種伴隨核移植動物出生的細胞周期專一性標記物來證明核移植所得后代來源于某一個特定細胞時相[8]。因此深入研究供體細胞類型、細胞周期、同步化處理方式以及細胞的倍增時間等在核移植胚胎發(fā)育過程中所起的作用顯得異常重要。

1.2 卵母細胞的體外成熟及激活

1.2.1 卵母細胞的體外成熟

體細胞核移植中體細胞必須在去核的卵母細胞內(nèi)進行重編程，以恢復其全能性，而卵母細胞的成熟程度則會直接影響體細胞的重編程過程。所以卵母細胞的體外成熟，作為體細胞核移植過程中的一個關鍵環(huán)節(jié)而為人們所關注。

目前關于哺乳動物卵母細胞的體外成熟還存在很多的問題，有人提出將卵母細胞的成熟分為3個方面：核的成熟、胞質(zhì)的成熟、分子的成熟。目前對卵母細胞的成熟的判斷只是通過形態(tài)學上的觀察，或者通過對囊胚率、受孕率及產(chǎn)仔率來進行驗證性地判斷，而要從根本上解決卵母細胞的體外成熟問題，還要加強對于卵母細胞成熟機制方面的研究[9]。

1.2.2 卵母細胞的激活

自然狀況下或體外受精時，精子的進入會啟動停滯于MⅡ期的卵母細胞繼續(xù)發(fā)育，這一過程稱為卵母細胞的激活。以成熟卵母細胞為受體的核移植中，由于缺乏諸如受精等自然的過程，故必須對卵母細胞進行人工激活以促使其進一步發(fā)育。一些物理或化學因素也可以使卵母細胞活化。目前應用較多的激活方法有電激活、乙醇、離子霉素、氯化鍶、三磷酯酰、精子提取物激活等。

1.3 去核

在細胞核移植研究中，去核這一步非常關鍵。采用的去核方法主要有半卵去核法、功能性去核法、離心去核法、化學去核法、擠壓去核法、點壓去核法和蔗糖輔助去核法等，但目前使用較多的仍然是盲吸收去核法和活性熒光染色去核法。

1.4 細胞核移植

供體核的移植主要有融合和注射兩種方法，融合包括化學融合、仙臺病毒融合與電融合，目前采用較多的是電融合。注射包括微細玻璃針和piezoelectric顯微注射兩種，均有成功的例子。

1.5 融合-激活

目前采用的融合-激活方案有3種：（1）融合前激活，即在卵母細胞與供核體細胞融合前激活卵母細胞；（2）融合時激活，即在將供受體融合的同時激活卵；（3）融合后激活，即在供受體融合后數(shù)小時再激活，可延長核在受體胞質(zhì)內(nèi)的時間，使重編程更徹底[10]。

1.6 重構(gòu)胚的體外培養(yǎng)和胚胎移植

重構(gòu)胚需一定時間的培養(yǎng)，方可移植到受體。家兔和豬重構(gòu)胚在體外培養(yǎng)24 h以內(nèi)，就可通過非手術移植，而羊和牛重構(gòu)胚所需培養(yǎng)時間較長，一般發(fā)育到囊胚或桑椹胚時移植。培養(yǎng)的方法是可將電融合的重構(gòu)胚放入10%FCS的RD微滴內(nèi)培養(yǎng)，也可將顯微操作的胚胎移入同種或異種的輸卵管中進行培養(yǎng)幾天后沖洗輸卵管，回收重構(gòu)胚[11]。核移植重構(gòu)胚成功發(fā)育取決于一系列的因素，如卵子的質(zhì)量、重構(gòu)的程序、培養(yǎng)的條件、受體和供體細胞的細胞周期階段等。前面幾個因素都是實驗技術方面的問題，受體和供體細胞的細胞周期階段則是涉及到核質(zhì)相互關系問題，這是取決于重構(gòu)胚成功發(fā)育最關鍵的因素之一。

在體外進行重構(gòu)胚的培養(yǎng)時選擇適當?shù)呐囵B(yǎng)液非常重要。重構(gòu)胚的移植與胚胎移植的方法基本一樣，即根據(jù)受體動物的不同可分為手術移植和非手術移植。

2 哺乳動物核移植的研究現(xiàn)狀

1997年，世界上第1只成年綿羊乳腺上皮細胞核移植后代Dolly的誕生，標志著核移植技術進入了一個嶄新的發(fā)展階段。這一成就具有劃時代的意義，而且進一步證實了基因活性學說的正確性，證明高度分化的體細胞仍然具有基因組的等同性，其細胞核仍然具有支持哺乳動物全程發(fā)育的全能性。

2.1 哺乳動物核移植細胞類型

核移植所用細胞包括動物干細胞、胎兒體細胞和成年體細胞等，由于建立大動物和人的干細胞系比較困難，因此目前的核移植研究多用后兩種細胞。此后，以不同動物不同組織來源的體細胞進行核移植均得到了后代，這些細胞包括顆粒/卵丘細胞、鼠尾尖細胞、乳腺細胞、皮膚成纖維細胞、輸卵管和子宮上皮細胞、轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染的牛生殖嵴細胞、牛肌肉細胞、牛初乳乳腺上皮細胞、肺組織細胞、兔成纖維細胞等。

2.2 哺乳動物的核移植研究

自從1997年Willmut等利用成年綿羊乳腺細胞作為供核細胞，獲得體細胞克隆羊Dolly后，哺乳動物的核移植研究在全世界范圍內(nèi)廣泛開展，并陸續(xù)獲得了多種動物的克隆后代。1998年，Wakayama等得到克隆的再克隆小鼠。1999年，Baguisi等獲得克隆山羊。2000年，Polejaeva等和Onishi等獲得克隆豬。2002年，Chesne等獲得克隆兔。2002年，Shin等獲得克隆貓。2003年，Galli等獲得克隆馬。2003年，Zhou等獲得克隆大鼠。

2.3 哺乳動物的異種核移植研究

1992年Wolf等人進行了將牛胚胎細胞核移入水牛、山羊、綿羊和倉鼠去核卵母細胞中的實驗。1993年，梅祺等進行小鼠與兔的胚胎細胞核移植。1998年，Wells成功利用普通牛卵母細胞和1頭珍稀印度野牛體細胞獲得成活的異種克隆后代。2001年，美國ACT公司獲得了1頭野牛與家牛的異種克隆后代，這頭野牛是世界上第1頭采用異種克隆技術克隆的哺乳動物，雖然該野牛在出生后2天死亡，但是證明了哺乳動物體細胞可以在異種動物卵母細胞內(nèi)完成核發(fā)育程序重編、去分化完成整個發(fā)育過程。同年Loi P等用歐洲盤羊的顆粒細胞為供體，移植到去核的綿羊的卵母細胞為胞質(zhì)受體構(gòu)建異種克隆胚，移植給代孕的母羊生產(chǎn)出1只具有明顯歐洲盤羊外貌特征的后代。2002年中國科學院動物研究所將處于2～4細胞期的大熊貓-兔異種克隆胚胎和貓-兔克隆胚胎一起移植到處理過的家貓輸卵管內(nèi)，得到的克隆胎兒中有兩個來源于大熊貓異種重構(gòu)胚。2003年馮秀亮等證明豬成熟MⅡ期卵母細胞可以對人體細胞核進行重新編程，并可支持其發(fā)育到囊胚階段。2004年SansinenaMJ等將爪哇野牛-牛異種克隆胚胎體外培養(yǎng)囊胚期移植給代孕的母牛體內(nèi)，其中1只妊娠維持到30～60 d，1只在60～90 d妊娠終止。2005年彭濤等發(fā)現(xiàn)盤羊-綿羊異種克隆胚胎和北山羊-山羊異種克隆胚胎移植入代孕母羊子宮內(nèi)能夠著床發(fā)育。2006年報道我國在人-山羊種間核移植試驗中沒有獲得囊胚，但是山羊的卵母細胞可以支持人體細胞完成重編程，重構(gòu)胚在體外可以完成早期發(fā)育[12]。

應用核移植技術獲得的動物大多是亞種間的核移植，但是已經(jīng)可以證明異種動物間的核移植技術的可行性。

3 哺乳動物核移植存在的問題

哺乳動物核移植技術雖然在生物醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)以及其他領域的應用取得了一定進展，但目前核移植技術還不夠完善。存活率和異常發(fā)育是當今核移植技術的最大缺陷，同體外受精相比，效率低是目前核移植技術應用發(fā)展中普遍存在的現(xiàn)象。需要在理論和實踐上得到進一步提高。主要表現(xiàn)在囊胚發(fā)育率不穩(wěn)定、移植后受胎率低、出現(xiàn)畸胎、死胎、流產(chǎn)以及出生后早亡率高。對造成效率低的原因意見不一，有人認為是培養(yǎng)條件未達到最佳化，也有人認為是細胞的問題。如細胞遺傳物質(zhì)受到損傷，細胞沒有完成發(fā)育程序重排或者由于遺傳印跡造成關鍵基因沒有充分表達等。即使是出生的個體也經(jīng)常出現(xiàn)一些異常，如胎盤過大、胎兒過大及呼吸系統(tǒng)疾病等。導致這些現(xiàn)象的原因很多，如卵母細胞質(zhì)量、供核細胞的種類、核質(zhì)互作關系、供核重新編程、操作水平、培養(yǎng)條件和外界環(huán)境等。

盡管目前來看，哺乳動物核移植仍然面臨很多問題，哺乳動物核移植技術自身仍在不斷完善中。但相信隨著分子遺傳學、細胞學、發(fā)育生物學等相關基礎學科的進一步發(fā)展，哺乳動物核移植將在未來的生物學及人體器官移植等方面扮演重要角色。

［1］朵紅.動物核移植技術研究概況.2005，35（4）:43-44.

［2］孫志宏，邱瑞，李延清，等.哺乳動物核移植研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學.2008，36（7）:2783-2784，2788.

［3］李勁松，陳大元.哺乳動物核移植中供核與受體卵胞質(zhì)細胞周期的相互關系 [J].生物化學與生物物理進展.2002，29（2）：206-210.

［4］匡穎，徐國江，王龍，等.哺乳動物體細胞核移植技術研究進展[J].中國生物工程雜志.2003，23（12）：43-47.

［5］Wakayama T，Perry A C F，Zoccotti M，et al.Full-tem development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei[J].Nature，1998，394（6691）:369～374.

［6］Zhou Q，Jouneau A，Brochard V，etal.Development potential of mouse embryos reconstructed from metaphase embryonic stem cell nuclei[J].Biol Reprod，2001，65（2）:412-419.

［7］Inoue K，Ogonuki N，Mochida K，et al.Effects of donor cell type and genotype on the efficiency of mouse somatic cell cloning[J].Biol Reprod，2003，69（4）:1394-1400.

［8］Lanza R P，Cibelli J B，Diaz C，et al.Cloning of endangered species（Bos Gaurus）using interspecies nuclear transfer[J].Bio.Reprod.，2001，64:1487-1493.

［9］趙磊文.卵母細胞體外成熟與體細胞核移植[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2006，05：56-57.

［10］張榮昌，岳福杰，李森遠，等.哺乳動物的克隆技術--哺乳動物克隆的原理、方法、影響因素及存在的問題[J].中國畜牧獸醫(yī)，2006，33（10）：55-55.

［11］李天晴，李躍民.哺乳動物核移植技術研究進展[J].草食家畜，2000，12（4）：1-3.

［12］廖清華，趙廣偉，何若鋼，等.動物異種核移植的研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36（30）：13064-13066.

S814.8

B

1005-2739（2010）01-0009-03

2009-09-21

寧方勇（1977-），男，講師，碩士。

白秀娟，女，教授。