王顯蘇，孫玉霞

（山東省釀酒葡萄科學(xué)研究所，山東 濟南 250100）

微生物技術(shù)在葡萄酒酵母選育中的應(yīng)用

王顯蘇，孫玉霞

（山東省釀酒葡萄科學(xué)研究所，山東 濟南 250100）

本文綜述了微生物技術(shù)在葡萄酒酵母選育中的應(yīng)用，主要包括天然酵母的篩選、定向馴化；誘變、雜交、原生質(zhì)體融合技術(shù)選育具有某種特性的葡萄酒酵母；并對基因技術(shù)對葡萄酒酵母的改良做了一定的介紹.

微生物技術(shù)；葡萄酒酵母；選育

根據(jù)國際葡萄與葡萄酒組織(OIV，1996)的規(guī)定，葡萄酒只能是破碎或未破碎的新鮮葡萄果實或葡萄汁經(jīng)完全或部分酒精發(fā)酵后獲得的飲料.在這一過程中起主導(dǎo)作用的微生物是釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），它對葡萄酒發(fā)酵具有根本性影響，它的性能不僅直接影響葡萄酒的產(chǎn)量、質(zhì)量和經(jīng)濟性，還對葡萄酒特色與風(fēng)格的形成至關(guān)重要.

葡萄汁的發(fā)酵可以是自然發(fā)酵，也可以是純種發(fā)酵.自然發(fā)酵是由葡萄上或釀酒廠中自然存在的微生物進行的發(fā)酵.產(chǎn)膜的假絲酵母(Candida)、葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniaspora)及釀酒酵母在自然發(fā)酵初期占據(jù)主導(dǎo)地位，主要來自葡萄漿果表面；發(fā)酵中期主要為畢赤氏酵母(Pichia)；后期則全部為酵母屬的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）[1].采用自然發(fā)酵時，發(fā)酵過程仍然會比較緩慢，產(chǎn)品質(zhì)量也不穩(wěn)定，另一方面早期雜酵母的生長所產(chǎn)生的次生代謝物質(zhì)積累，可能對葡萄酒品質(zhì)產(chǎn)生影響.

現(xiàn)代化的葡萄酒生產(chǎn)要求產(chǎn)品質(zhì)量保持穩(wěn)定，葡萄酒需要具有一貫的口感風(fēng)味.為了獲得迅速可靠的發(fā)酵，通常采用各種精選的商業(yè)酵母菌株.它們可以快速有效地催化將葡萄中的糖轉(zhuǎn)化為酒精的過程，同時不產(chǎn)生任何不良氣味.隨著消費者對葡萄酒品質(zhì)要求的不斷提高、口味的多樣化和更高的環(huán)保標(biāo)準(zhǔn)，釀酒師期望獲得具有各種特定性能的酵母菌株，從而提高葡萄酒的市場競爭力和商業(yè)價值，因此應(yīng)用微生物技術(shù)對葡萄酒酵母菌株進行選育和基因改良工作已逐漸成為這一領(lǐng)域的研究熱點.

1 葡萄酒酵母的篩選

受地域、氣候和土壤等因素的影響，各產(chǎn)區(qū)的葡萄品質(zhì)不盡相同，因而選用從當(dāng)?shù)仄咸褕@或釀酒廠分離、篩選出的優(yōu)良天然酵母進行發(fā)酵，釀制具有地域特色或獨特風(fēng)格的葡萄酒在產(chǎn)品日益同質(zhì)化的今天，是提高市場競爭力的有力措施.徐艷文[2]以莫高葡萄酒廠和祁連葡萄酒廠的葡萄生產(chǎn)基地的葡萄漿果表面、土壤、設(shè)備表面等為分離源分離葡萄酒相關(guān)酵母菌；王慧等[3]從山東、甘肅、寧夏、陜西、新疆釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)采集的99份葡萄果粒中分離到酵母258株，通過抗性和發(fā)酵特性評價，篩選出3株發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株.可供篩選的葡萄酒酵母來源廣泛，主要來自葡萄果皮表面、葡萄園園區(qū)土壤、發(fā)酵醪、發(fā)酵車間、酒窖及自然變異的生產(chǎn)菌株等.根據(jù)不同的要求，對于已獲取的優(yōu)良葡萄酒酵母，必須經(jīng)過多菌株的發(fā)酵比較，根據(jù)其發(fā)酵能力和發(fā)酵結(jié)果篩選出適合某種葡萄酒生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)酵母.

2 葡萄酒酵母的馴化

從自然界篩選的野生酵母，一般很難直接用于發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)，需要進一步的馴化培養(yǎng)，才能使其達到工業(yè)大生產(chǎn)的要求.進行菌種馴化時，根據(jù)所要達到的目標(biāo)，設(shè)置特定的培養(yǎng)條件，反復(fù)培養(yǎng)分離，直至達到預(yù)定的目標(biāo).工業(yè)上的菌種馴化工作主要是從克服環(huán)境的影響方面來進行的，如溫度、pH、酸度、糖度等各種脅迫環(huán)境，使之適應(yīng)工業(yè)發(fā)酵要求，提高產(chǎn)酒率，促進發(fā)酵過程的順暢，減少不必要的產(chǎn)物.宋安東等[4]對酵母Y02進行了耐高糖、耐酒精等性能的馴化實驗，經(jīng)馴化后的菌株可以耐受35%的糖度和25%的酒精度.

3 誘變育種

通過用物理因素或化學(xué)因素獲得誘變菌株是較簡單的直接改良酵母菌株的方法，應(yīng)用廣泛的物理手段有紫外線、X射線、γ-射線等，化學(xué)手段有硫酸二乙酯(DFS)、5- 溴尿嘧啶(5-BU)、氮芥(Nm)、亞硝基胍(NTG)等.尹吉泰等[5]使用EMS對出發(fā)菌株CⅠ進行誘變，通過蛋氨酸抗性平板，篩選出了一株產(chǎn)硫化氫低、產(chǎn)谷胱甘肽高的葡萄酒酵母.

4 雜交育種

雜交育種是利用酵母的生活史、不同遺傳特性和相反交配型的細胞產(chǎn)生的雙倍體等特點，可以消除菌株在經(jīng)歷長期誘變后所出現(xiàn)的產(chǎn)量性狀難以繼續(xù)提高的障礙，因此是一種重要的育種手段.如對白葡萄酒酵母R2進行紫外線誘變的方法進行定向選育和馴化，篩選出耐低溫菌株，再與耐酒精酵母進行有性雜交，篩選出在保持原有發(fā)酵性能的條件下具備耐低溫耐酒精的特性的菌株[6].

5 原生質(zhì)體融合

原生質(zhì)體融合技術(shù)又稱細胞融合技術(shù)，是指兩種不同的菌株經(jīng)酶法去壁后，得到的原生質(zhì)體(球)，置于高滲溶液中，在一定融合劑的促融作用下使兩者相互凝集并發(fā)生細胞之間的融合，進而導(dǎo)致基因重組，獲得融合了親本優(yōu)良性能的新菌株的育種方法.如李華等[7]對葡萄酒酵母 1450(Chxs、Ampr)和酒球菌SD22a(Chxr、Amps)的原生質(zhì)體制備方法進行了研究,并采用PEG和Ca2+促融的方法進行了兩菌株的跨界原生質(zhì)體融合，篩選出1株在酒精發(fā)酵的同時降解蘋果酸能力強的融合子.與其他育種技術(shù)相比，其具有雜交頻率較高、受接合型或致育型的限制較小和遺傳物質(zhì)更為完整，并且存在著兩株以上親株同時參與融合形成融合子的可能性等優(yōu)點，提高菌株產(chǎn)量和品質(zhì)的潛力較大.

6 基因工程技術(shù)

此項技術(shù)是利用基因工程手段，從生物體內(nèi)提取出所要表達的基因或人工合成的DNA片段，導(dǎo)入適當(dāng)?shù)妮d體，再轉(zhuǎn)入釀酒酵母細胞中，使遺傳物質(zhì)重新組合，從而實現(xiàn)對葡萄酒酵母的改良.改良后的酵母在葡萄酒酸度調(diào)解、增香、抗氧化、提高功能成分的含量及降低不良物質(zhì)影響等方面具有潛在的應(yīng)用價值.

6.1 酸度調(diào)整

有機酸是葡萄酒的重要成分之一，其含量影響著葡萄酒的質(zhì)量和口感.北方一些葡萄酒產(chǎn)區(qū)，在葡萄成熟期，氣溫偏低且多雨，這導(dǎo)致葡萄漿果含酸量高，因此降酸就成了葡萄酒釀造中的必要步驟.其中生物降酸既能有效地降低酒的酸度，又增加了葡萄酒的生物穩(wěn)定性，因此成為近年來葡萄酒降酸的主要研究方向.Bony等[8]進行了蘋果酸-乳酸酶基因mleS和粟酒裂殖酵母蘋果酸通透酶基因mae1在釀酒酵母中的共表達研究，結(jié)果表明轉(zhuǎn)化子能徹底降解蘋果酸；李華等[9]通過克隆包含mleA和mleP基因的mle基因座并轉(zhuǎn)化釀酒酵母，使其中的mleA基因得到外源表達，部分L-蘋果酸降解生成乳酸.

6.2 增加香氣

葡萄酒的特征果香成分和典型風(fēng)格主要來自于葡萄中的香味物質(zhì)，而葡萄漿果中的呈香物質(zhì)(包括非呈香前體)多以糖苷的形式存在于果皮和果汁中，在酒精發(fā)酵過程中，存在于漿果及酵母中的糖苷酶水解糖苷，促進香味物質(zhì)如單萜類物質(zhì)釋放到酒中，但存在于葡萄漿果及釀酒酵母中的糖苷酶種類有限，且受到葡萄糖的強烈抑制，所以人們開始探索運用基因重組手段構(gòu)建水解糖苷能力強的釀酒酵母.Pérez-González等[10]克隆了長臂木霉（Trichodema longibrachiatum）的 β-（1，4）- 內(nèi)切葡聚糖酶基因egl1，使其在葡萄酒酵母T73中表達，Ganga 等[11]將構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）的β-（1，4）-內(nèi)切木聚糖酶基因xlnA拷貝到葡萄酒釀酒酵母中并使其表達，經(jīng)重組酵母發(fā)酵獲得的葡萄酒的果香均有明顯增加.而對于那些萜烯醇含量較少或無香葡萄品種，óscar Herrero等運用代謝工程修飾類異戊二烯的生物合成途徑，將科勒氏酵母（Clarkia breweri）的里那醇合成酶基因在葡萄酒酵母中表達，在微型釀酒實驗中，重組酵母分泌出的里那醇遠遠超出了它的閾值[12].

6.3 抗氧化

白葡萄酒在生產(chǎn)過程中極易發(fā)生褐變，影響其外觀質(zhì)量，工業(yè)上可采用添加SO2、抗壞血酸等方法除祛酒中的氧，防止白葡萄酒氧化，但隨著越來越多的消費者要求無化學(xué)添加劑的產(chǎn)品，構(gòu)建能夠分泌葡萄糖氧化酶的基因重組酵母成為一條可利用途徑.Malherbe 等[13]將黑曲霉（Aspergillus niger）的葡萄糖氧化酶基因gox導(dǎo)入釀酒酵母中，構(gòu)建了具備葡萄糖氧化酶活力的基因工程酵母.

6.4 提高功能成分含量

白藜蘆醇主要有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗氧化、抗自由基、保護肝臟、保護心血管和抗心肌缺血等功能，其中,最令人矚目和最有發(fā)展前景的是抗腫瘤作用,被喻為繼紫杉醇之后的又一新的綠色抗癌藥物，而葡萄是白藜蘆醇含量較多的植物之一.為使葡萄中的白藜蘆醇盡可能多的在釀造過程中轉(zhuǎn)入葡萄酒中，Sánchez-Torres等將假絲酵母（Candida molischiana）中編碼β-葡萄糖苷酶的基因bgIN導(dǎo)入葡萄酒釀酒酵母中，并使其表達[14]，隨后González-Candelas等研究發(fā)現(xiàn)，這種重組酵母發(fā)酵生產(chǎn)的葡萄酒中白藜蘆醇的含量明顯升高[15].

6.5 降低不良成分的影響

6.5.1 有害微生物.在葡萄酒的生產(chǎn)過程中，有害微生物的生長會改變產(chǎn)品的化學(xué)組成，使其外觀、香氣和風(fēng)味發(fā)生惡性改變.目前，除加強衛(wèi)生管理外，添加二氧化硫是最常用的防止微生物污染的方式.但面對消費者日益增長的抵制和生物抑菌劑高昂的價格，構(gòu)建嗜殺酵母也是解決問題的有效措施.如編碼雞蛋蛋清溶菌酶基因HEL1、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）的片球菌素基因PED1和明串珠菌屬（Leuconostoc carnosum）的明串珠菌素基因LCA1都已用在具有殺菌能力的工程酵母菌[16].

6.5.2 不安全物質(zhì).葡萄酒的釀造過程中，也會產(chǎn)生某些微量的有害物質(zhì)，如氨基酸的代謝產(chǎn)物與乙醇反應(yīng)能生成疑有致癌性的化合物氨基甲酸乙酯（ethylcarbamate）.已有研究證實葡萄酒在蘋果酸-乳酸發(fā)酵（MLF）過程中，蘋果酸-乳酸菌（MLB）的精氨酸代謝途徑即精氨酸脫亞氨基酶途徑(Arginine deiminase pathway，簡稱ADI途徑)是產(chǎn)生EC的重要途徑[17].目前法國和阿根廷已經(jīng)完成O.oeni和L.hilgardii的arc簇基因全序列測序，因此除在生產(chǎn)工藝條件上嚴(yán)加控制外，是否可以構(gòu)建基因工程菌株來阻斷ADI途徑以降低葡萄酒中此類物質(zhì)的含量有待于進一步的研究.

7 前景與展望

微生物技術(shù)的發(fā)展為葡萄酒工業(yè)奠定了基礎(chǔ)，為葡萄酒酵母的選育提供了更多的可能和選擇空間；同時微生物技術(shù)在二十一世紀(jì)為提高葡萄酒的品質(zhì)，降低優(yōu)質(zhì)葡萄酒的生產(chǎn)成本，滿足不同消費者多元的個性化需求做出更大的貢獻.

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