黃文達(dá),趙學(xué)勇,趙 昕,趙哈林,連 杰,王少昆

（1.中國(guó)科學(xué)院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所,甘肅蘭州 730000；2.中國(guó)科學(xué)院研究生院,北京 100039）

近年來(lái),種群遺傳學(xué)已經(jīng)逐漸發(fā)展壯大。這門學(xué)科有3個(gè)重要組成部分:有效檢測(cè)DNA信息片段的技術(shù)[1-2]；對(duì)DNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；方便快捷的計(jì)算機(jī)軟件應(yīng)用[3],這使得利用分子遺傳學(xué)數(shù)據(jù)將生物固有的特性緊密地聯(lián)系在一起成為可能,從而在不同的生物等級(jí)中揭露其特有但至今尚未發(fā)現(xiàn)的信息[4]。目前,由遺傳數(shù)據(jù)得到的基因族譜信息和單基因位點(diǎn)遺傳標(biāo)記技術(shù),已經(jīng)能夠有效地回答一些生物學(xué)問(wèn)題,同時(shí)為進(jìn)化生物學(xué)、種群生物學(xué)和保護(hù)生物學(xué)的發(fā)展也提供了技術(shù)支持。

1 種群遺傳學(xué)的研究進(jìn)展

種群間不同個(gè)體的基因組DNA序列存在差異,這種變異通常發(fā)生在個(gè)體基因（或基因型）水平。某個(gè)基因是否會(huì)發(fā)生變異在時(shí)間和空間上受其他生物和個(gè)體的影響,而且變異會(huì)通過(guò)繁殖、遷徙、種群大小改變和自然選擇在個(gè)體間傳遞。利用種群遺傳模式,探討種群統(tǒng)計(jì)特征和分子遺傳變異分布之間的聯(lián)系[5],可以對(duì)有機(jī)體的生物學(xué)信息做出一定的推斷。遺傳變異對(duì)個(gè)體的影響最終導(dǎo)致對(duì)整個(gè)種群的影響,這個(gè)過(guò)程反過(guò)來(lái)也影響物種形成和物種的等級(jí)分類[6]。因此,利用不同的遺傳標(biāo)記對(duì)個(gè)體遺傳變異水平進(jìn)行研究,可以獲得任何一個(gè)種群及其進(jìn)化過(guò)程中任一階段的正確信號(hào)和信息。

分子標(biāo)記在種群生物學(xué)中的應(yīng)用性,將為不同級(jí)別的種群生物學(xué)提供信息。首先,最敏感的遺傳信號(hào)是基因型數(shù)據(jù)組成（genotypic arrays）,運(yùn)用微衛(wèi)星定位的方法,通常能在抽樣個(gè)體中發(fā)現(xiàn)這種信號(hào)。在有性繁殖的物種中,這些數(shù)據(jù)組合會(huì)代代改組,因此有利于規(guī)模性種群的快速形成,例如親子關(guān)系和相互作用的個(gè)體之間的關(guān)系識(shí)別[7-10]。不過(guò),在沒(méi)有頻繁遺傳重組的有機(jī)體中通常能識(shí)別這種數(shù)據(jù)組合[11]。其次,微衛(wèi)星定位、線粒體DNA和其他的單基因標(biāo)記也可以用于個(gè)體基因分析,揭示其發(fā)生重組的頻率和地理分布的遺傳分析。比起基因型數(shù)組,這些研究方法的變化在較大的時(shí)間和空間尺度上是有效的遺傳標(biāo)記,這些標(biāo)記可以說(shuō)明基因流和種群史,即使是存在有限遺傳變異的物種[12-13]。第三,發(fā)生突變以后,新等位基因的產(chǎn)生過(guò)程會(huì)很慢,因此,新等位基因之間進(jìn)化關(guān)系（等位基因和基因族譜,或系統(tǒng)發(fā)育）的分析是富有信息的。同時(shí),這種過(guò)程也是系統(tǒng)地理學(xué)、形態(tài)學(xué)和較深的分類系統(tǒng)發(fā)育體系重建的長(zhǎng)期過(guò)程[6]。

2 分子標(biāo)記在種群遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用

用于種群遺傳分析的遺傳學(xué)技術(shù),是一個(gè)令人費(fèi)解的基因型數(shù)據(jù)組合[4]。但是,把研究重點(diǎn)放在技術(shù)本身不同的研究特性方面,會(huì)有助于對(duì)種群遺傳分析方法的理解。遺傳標(biāo)記只是每個(gè)位點(diǎn)上具有豐富信息的遺傳特征。通常,在一個(gè)二倍體有機(jī)體內(nèi),每個(gè)位點(diǎn)上可以有1～2個(gè)不同的等位基因。所有的遺傳標(biāo)記都能反映DNA序列的差異,因此,通常應(yīng)該在數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便之間做一個(gè)權(quán)衡。每個(gè)獨(dú)立的位點(diǎn)都能對(duì)假設(shè)進(jìn)行獨(dú)立檢測(cè)。因此,若許多個(gè)位點(diǎn)都分別對(duì)假設(shè)進(jìn)行獨(dú)立檢測(cè),將能產(chǎn)生大量敏感的數(shù)據(jù)組合。遺傳變異通常是按等級(jí)分布的,例如,一個(gè)個(gè)體內(nèi)的2個(gè)等位基因,一個(gè)亞種群內(nèi)的N個(gè)個(gè)體和一個(gè)種群內(nèi)的Y個(gè)亞種群。因此,數(shù)據(jù)要能經(jīng)得起分析檢驗(yàn),運(yùn)用的方法要與生態(tài)學(xué)家們認(rèn)可的主要統(tǒng)計(jì)學(xué)方法密切相關(guān),包括方差分析、空間自相關(guān)因素分析等。與此同時(shí),根據(jù)研究特性,對(duì)不同遺傳學(xué)技術(shù)進(jìn)行篩選,以便得到較為可靠的遺傳數(shù)據(jù),從而提高種群遺傳分析的準(zhǔn)確性。

2.1 分子標(biāo)記的選擇若要對(duì)某個(gè)種群進(jìn)行遺傳調(diào)查,選擇恰當(dāng)?shù)倪z傳標(biāo)記將是一個(gè)良好的開(kāi)端。遺傳調(diào)查時(shí)存在的主要問(wèn)題和具體標(biāo)記方法的屬性如下。

2.1.1靈敏性 用來(lái)解決問(wèn)題的標(biāo)記必須要有正確反映信息的能力。研究對(duì)象可能會(huì)存在很多遺傳信息（如果個(gè)體之間差異太大,那它們之間就沒(méi)有任何聯(lián)系）或很少的信息（沒(méi)有信號(hào)）。研究過(guò)程中不斷地進(jìn)行數(shù)據(jù)積累,了解不同的分子標(biāo)記能夠較為準(zhǔn)確地表達(dá)不同水平的遺傳信息。在許多能夠恰當(dāng)分辨的標(biāo)記之間,應(yīng)該選擇更切合實(shí)際的標(biāo)記。

2.1.2多位點(diǎn)或單個(gè)位點(diǎn) 通常情況下,要考慮到遺傳標(biāo)記的實(shí)用性和準(zhǔn)確性2個(gè)方面。多位點(diǎn)DNA技術(shù),如 RAPDs（DNA隨即擴(kuò)增多態(tài)性）[14-22]、AFLP（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性）、RFLP（限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性）[23]、ISSR（簡(jiǎn)單序列重復(fù)）[24-31]、ITS區(qū)（DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）[30-35]等；單位點(diǎn)技術(shù),如常用微衛(wèi)星和單拷貝核（scn）DNA區(qū)等。多位點(diǎn)的研究方法在技術(shù)上便于操作,但也存在很多明顯的弱點(diǎn)和局限性,其中包括利用這些方法檢測(cè)到的遺傳變異在很大程度上是非遺傳的或甚至不是源于目的有機(jī)體。這些缺點(diǎn)已經(jīng)在植物、哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類研究中被證明[36-37]。相比之下,單位點(diǎn)標(biāo)記更為靈活,內(nèi)容豐富并且可以聯(lián)系在一起,因?yàn)榭梢苑治龌蛐蛿?shù)組、等位基因頻率和基因族譜[38]。也有人認(rèn)為,多位點(diǎn)技術(shù)更經(jīng)濟(jì)[39]。單位點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展,使得RAPD標(biāo)記被忽視,其表現(xiàn)在一個(gè)高水平趨異進(jìn)化的同形種、種內(nèi)基因流和高水平的基因重組以及生物學(xué)更復(fù)雜的方面。但是考慮到比較數(shù)據(jù)組合的重要性時(shí),單位點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)更為經(jīng)濟(jì)[38]。

許多研究表明,種群遺傳分析不能使用多態(tài)位點(diǎn)的數(shù)據(jù),主要因?yàn)槎鄳B(tài)位點(diǎn)技術(shù)不能提供的位點(diǎn)內(nèi)和位點(diǎn)間等位基因的特性比較,從而對(duì)種群遺傳做出分析。但是,多態(tài)位點(diǎn)技術(shù)能產(chǎn)生許多可變帶,因此被廣泛地應(yīng)用在基因圖譜構(gòu)建和數(shù)量性狀分析中[40]。

2.1.3基因譜系 關(guān)于種群數(shù)量統(tǒng)計(jì)和基因譜系之間相關(guān)性的分析是種群生物學(xué)的一個(gè)主要發(fā)展領(lǐng)域,也催生了一些具有創(chuàng)新性的研究成果,種群的形成過(guò)程能幫助我們更好地理解種群生物學(xué)[3-4,6,13,41]。例如,分子系統(tǒng)發(fā)育是幫助從“小冰期”的影響中[41]理清當(dāng)前的系統(tǒng)發(fā)育情況并獲得長(zhǎng)期種群統(tǒng)計(jì)信息保護(hù)計(jì)劃的唯一途徑[6]?；蜃遄V的基礎(chǔ)是同源DNA序列的重組。一個(gè)染色體上的2個(gè)位點(diǎn)重組事件發(fā)生的可能性決定于它們的物理距離,因此遺傳連鎖圖譜可以作為物理圖譜的一種參考[42]。嵌套分支分析是制定一個(gè)特別清晰的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)和假設(shè)測(cè)試框架,并且可以通過(guò)計(jì)算機(jī)程序執(zhí)行[41]。從種群形成的時(shí)間和空間的細(xì)節(jié)推斷可以找到一些參考信息,以及形成相應(yīng)的基因族譜,從而更加確定其推論的準(zhǔn)確性。因此,研究者收集不同生物種群的數(shù)據(jù)信息,并進(jìn)行基因族譜分析,最終整合生物學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育概念[43]。

2.1.4細(xì)胞器和細(xì)胞核DNA 大多數(shù)真核生物細(xì)胞中,含有可遺傳的雙親信息的核DNA,以及通?？蛇z傳的單親信息的細(xì)胞器DNA（線粒體和植物葉綠體）。信息傳遞方面的差異,以及一些進(jìn)化模式的主要分歧,產(chǎn)生了細(xì)胞器 DNA和核DNA基因族譜,以反映種群生物學(xué)和種群歷史的不同方面。線粒體DNA較核DNA標(biāo)記所得的Ne值小,并因此在多數(shù)種群分布統(tǒng)計(jì)情況下,線粒體DNA變種使得生物分類診斷變得更迅速。線粒體和核基因型的比較能幫助識(shí)別雜合體。非對(duì)稱雜交偏好和變種祖先類群的多態(tài)性隨機(jī)效應(yīng),能導(dǎo)致某些基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)與類群所攜帶的信息不匹配[41]。因此,一般最好使用一套能夠檢測(cè)這種跡象的標(biāo)記。

如果遺傳標(biāo)記能較早地開(kāi)發(fā),并且盡可能地篩選,就會(huì)使研究過(guò)程更加省時(shí)省力,從而有助于提高工作效率。在評(píng)估候選標(biāo)記的相對(duì)適用性時(shí),應(yīng)該考慮技術(shù)操作的便利性。

2.2 遺傳數(shù)據(jù)分析種群遺傳分析最大限度地應(yīng)用了最大似然法、貝葉斯統(tǒng)計(jì)學(xué)技術(shù),以便從遺傳數(shù)據(jù)中提取大量信息[3,43-44]。利用DNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析是分子進(jìn)化研究的必要手段。要解決特定的系統(tǒng)發(fā)生問(wèn)題,首先要挑選合理的分類群及序列,盡量減少數(shù)據(jù)的偏倚,然后選擇構(gòu)樹(shù)方法,最后還要對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)并給出進(jìn)化學(xué)上的解釋[45]?；蚪M程序化表達(dá)調(diào)控與生物體形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生的相互對(duì)應(yīng)是圖式遺傳學(xué)和系統(tǒng)生物技術(shù)研究復(fù)雜生物系統(tǒng)的核心[46]；基因族譜分析側(cè)重于研究同一物種不同種群內(nèi)個(gè)體等位基因之間的進(jìn)化關(guān)系[41]。這些技術(shù)（主要是“合并方法”[3,6,41]和“嵌套分化枝分析”[41]）能夠?qū)v史和空間的假說(shuō)進(jìn)行明確的測(cè)試,例如從以前的基因流中區(qū)分出目前受限制的基因流,調(diào)查受限制基因流的發(fā)展方向。最后,分子進(jìn)化學(xué)的變化模型正在精細(xì)化,并且能大大提高譜系推理的合理性。這些發(fā)展能使人們了解種群生物學(xué)的基本進(jìn)展。Luikart和 England[44]引用了26種不同的遺傳分析方法,對(duì)4種類型的種群生物學(xué)進(jìn)行研究,其中包括關(guān)聯(lián)性和親子關(guān)系、擴(kuò)散和遷徙、近親繁殖和有效的種群大小（Ne值）,實(shí)驗(yàn)得到了一些全新的數(shù)據(jù)信息,而這些數(shù)據(jù)信息主要通過(guò)微衛(wèi)星定位分析方法研究所得。微衛(wèi)星定位分析的研究取得了很大進(jìn)步,其中對(duì)非平衡態(tài)情況的遺傳分析,主要應(yīng)用在保護(hù)生物學(xué)和入侵生物的研究中[13,41]。

種群遺傳學(xué)的當(dāng)前繁榮主要源于方便快捷的電腦軟件,例如GENEPOP（http://www.cefe.cnrs-mop.fr/）、PH YLIP和 PAUP[47-48]。不過(guò),盡管包括GENEPOP在內(nèi)的電腦軟件之間的互補(bǔ)性大大促進(jìn)了該領(lǐng)域的發(fā)展,但仍然有很大的發(fā)展空間[49]。

總的來(lái)說(shuō),隨著分子生物學(xué)研究的深入,越來(lái)越多新的分子標(biāo)記技術(shù)最終會(huì)被發(fā)現(xiàn),對(duì)各種種群遺傳變異分析也提出了新的挑戰(zhàn),如何利用計(jì)算機(jī)程序和網(wǎng)絡(luò)信息對(duì)復(fù)雜數(shù)據(jù)的處理能力將成為今后種群遺傳分析的重點(diǎn)。

3 存在問(wèn)題及展望

以DNA序列為核心的分子標(biāo)記技術(shù),即建立在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上的DNA測(cè)序分析技術(shù)（DNA sequencing）。該技術(shù)的開(kāi)發(fā)使DNA分子標(biāo)記技術(shù)取得了突破性的進(jìn)展[50-52]。近年來(lái),由于DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使得人們對(duì)一些基因結(jié)構(gòu)[53-55]、功能進(jìn)化規(guī)律的認(rèn)識(shí)更加深入,其中一些基因已用于動(dòng)植物的進(jìn)化與分類研究[26,56-60]。

目前,基于PCR的DNA直接測(cè)序技術(shù)在種群遺傳學(xué)中的應(yīng)用己成為國(guó)際上相當(dāng)活躍的研究領(lǐng)域。但文獻(xiàn)報(bào)道主要集中在歐美,我國(guó)在這方面的研究還相當(dāng)滯后,僅見(jiàn)為數(shù)不多的報(bào)道,如一些特有物種[61]以及瀕危樹(shù)種的研究[62]。制約因素主要是技術(shù)應(yīng)用存在局限性,實(shí)驗(yàn)成本較高、操作過(guò)程中對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的要求較高等,使得用于種群遺傳學(xué)研究的方法很少。其次,數(shù)據(jù)分析的軟件也有一定局限性,常規(guī)的研究指標(biāo)已經(jīng)顯得比較單一。因此,作為方法學(xué)的研究,在種群遺傳學(xué)研究中還應(yīng)加大研究力量的投入,選擇和發(fā)展出更適合種群遺傳學(xué)研究的分子標(biāo)記技術(shù)。同時(shí),僅僅依靠分子生物學(xué)技術(shù)在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)還不能全面深入地解決種群遺傳學(xué)研究中的問(wèn)題,應(yīng)該選擇多種方法進(jìn)行協(xié)同分析,比如分子標(biāo)記技術(shù)與細(xì)胞學(xué)標(biāo)記技術(shù)、生化標(biāo)記技術(shù)等協(xié)同使用,從而促進(jìn)種群遺傳學(xué)的進(jìn)展取得更加輝煌的成就。

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