何士敏，李昌滿，于文博

（長(zhǎng)江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，重慶涪陵，408100）

莖瘤芥 （Brassica junceaCoss.var.tumida Tsen et Lee）的瘤莖表皮青綠光滑，皮下肉質(zhì)色白而肥厚，質(zhì)地脆嫩。瘤莖部分，即青菜頭，一般每個(gè)質(zhì)量0.5 kg左右，大者1～1.5 kg。莖瘤芥用途十分廣泛，煮熟的青菜頭拌上調(diào)料食用十分可口；其煮后的湯有一種雞湯式的鮮味。用青菜頭制成的泡菜，顯得嫩脆別致?，F(xiàn)代科學(xué)化驗(yàn)證明，它的營(yíng)養(yǎng)十分豐富，每500 g青菜頭含有蛋白質(zhì) 20.5 g、糖 45 g、鈣 1 400 mg、磷 650 mg、鐵 33.5 mg。莖瘤芥還是做榨菜的主要原料，現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)認(rèn)為，榨菜能健脾開(kāi)胃、補(bǔ)氣添精、增食助神；低鹽保健型榨菜還能起到保肝減肥的作用；榨菜有“天然暈海寧”之說(shuō)，暈車暈船者在口中放一片榨菜咀嚼，會(huì)使煩悶情緒緩解；飲酒不適或過(guò)量時(shí)，吃一點(diǎn)榨菜可以緩解酒醉造成的頭昏、胸悶和煩躁感[1]。因此，莖瘤芥在人們?nèi)粘Ｉ钪械牡匚皇呛苤匾摹Ｄ壳?，加?qiáng)我國(guó)莖瘤芥種子生產(chǎn)和種子活力方面的研究已經(jīng)引起研究人員的高度重視，如果在堅(jiān)持良種繁育和品種復(fù)壯的同時(shí)，又采取提高種子活力的措施，則能大大提高我國(guó)莖瘤芥的產(chǎn)量。

過(guò)氧化氫作為種子萌發(fā)促進(jìn)劑，以價(jià)格低廉、使用方便，在科研和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上得到廣泛應(yīng)用[2～3]。因此，本文研究了不同濃度的過(guò)氧化氫對(duì)莖瘤芥種子萌發(fā)的影響，探討提高莖瘤芥種子活力的途徑，旨在為莖瘤芥生產(chǎn)實(shí)踐提供一些科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的莖瘤芥種子有：涪陵早豐、鵝公雪松和永安小葉等3個(gè)品種，由重慶涪陵何亞種子經(jīng)營(yíng)部供種。

1.2 試驗(yàn)方法

①種子發(fā)芽試驗(yàn) 取15套中等型號(hào)的培養(yǎng)皿，分為3個(gè)組，每組5套，在每個(gè)培養(yǎng)皿中放入籽粒飽滿、顏色健康的莖瘤芥種子50粒，再用適量（剛好浸沒(méi)種子上表面）蒸餾水（對(duì)照），0.01%，0.1%，1%，3%的 H2O2溶液分別浸泡，加蓋，處理12 h。將浸種后的種子洗凈，置于經(jīng)高壓滅菌、墊有2層濕潤(rùn)紗布的培養(yǎng)皿中，并加入適量蒸餾水，在25℃光照下進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)，每天記載發(fā)芽種子數(shù)，并用蒸餾水清洗1次種子。

試驗(yàn)過(guò)程中統(tǒng)計(jì)供試種子數(shù)、逐日實(shí)際發(fā)芽數(shù)和平均苗長(zhǎng)（m），計(jì)算種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率高峰值、活力指數(shù)[2]。a.發(fā)芽指標(biāo)測(cè)定。發(fā)芽后測(cè)定過(guò)氧化物酶活性和多酚氧化酶活性。發(fā)芽率（%）=發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)×100%；發(fā)芽指數(shù)=∑（Gt/Dt）（Gt為 t時(shí)間內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)）[4]；活力指數(shù)=平均苗長(zhǎng)×發(fā)芽指數(shù)。

b.過(guò)氧化物酶（POD）活性測(cè)定。參照俞建英等[7]的方法，略有改動(dòng)。稱取經(jīng)處理后的種子萌發(fā)的芽0.2 g，加20 mmol/L KH2PO45 mL，于研缽中冰浴研磨成勻漿，以4 000 r/min離心15 min，收集上清夜保存在冷處，所得殘?jiān)儆? mL KH2PO4溶液提取1次，合并2次上清液作為酶液保鮮備用。取光徑1 cm比色杯2只，于1只中加入反應(yīng)混合液3 mL，KH2PO40.5 mL，作為校零對(duì)照，另1只中加入反應(yīng)混合液3 mL，上述酶液0.5 mL，立即開(kāi)啟秒表記時(shí)，于分光光度計(jì)470 nm波長(zhǎng)下測(cè)量OD值，每隔1 min讀數(shù)1次，一共讀5 min。以平均每分鐘OD的變化量表示酶活性大小。

c.多酚氧化酶（PPO）活性測(cè)定。參照李敏等[8]的方法，略有改動(dòng)。稱取經(jīng)不同處理后的種子萌發(fā)的芽0.2 g，加pH值7.6的磷酸緩沖液10 mL，在研缽中冰浴研磨成勻漿轉(zhuǎn)入離心管，以4 000 r/min離心15 min，取其上清液作為酶液。然后取2只光徑1 cm的比色杯，于1只中加入pH值磷酸緩沖液1 mL，0.2 mol/L鄰苯二酚溶液1 mL，作為校零對(duì)照。另1只中加入pH值7.6磷酸緩沖液1 mL，0.2 mol/L鄰苯二酚溶液1 mL，上述酶液0.5 mL，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)410 nm條件下測(cè)定OD值，每5 s記錄1次。酶活力單位為每分鐘引起吸光度改變0.001所需的酶量。

②過(guò)氧化氫對(duì)種子電解質(zhì)外滲率的影響 參照張志良[5]的方法，略有改動(dòng)。先測(cè)定活種子外液電導(dǎo)率：對(duì)3個(gè)品種的莖瘤芥種子分別用適量蒸餾水，0.01%，0.1%，1%，3%H2O2浸泡處理 24 h，然后取處理后的種子各50粒，用蒸餾水洗凈，再用濾紙吸干。最后將種子放入500 mL錐形瓶中，加蒸餾水250 mL，保持24 h，搖動(dòng)錐形瓶，使溶液均勻，過(guò)濾到250 mL燒杯中，用DDS_11A型電導(dǎo)率儀測(cè)定溶液的電導(dǎo)率。

其次，測(cè)定死種子外液電導(dǎo)率：分別用蒸餾水，0.01%，0.1%，1%，3%H2O2溶液對(duì) 3 個(gè)品種的莖瘤芥種子進(jìn)行浸泡處理24 h，取處理后的種子各50粒，用蒸餾水洗凈，再用濾紙吸干，將種子放在500 mL燒杯中，加蒸餾水250 mL，在電爐上加熱20 min將其煮死，待溶液冷卻之后，滴加蒸餾水至加熱前的刻度，以補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水分，搖動(dòng)燒杯，使溶液均勻，再過(guò)濾到250 mL燒杯中，測(cè)定溶液的電導(dǎo)率。

電解質(zhì)外滲率（%）=活種子外液電導(dǎo)率/煮死種子外液電導(dǎo)率×100%[6]。

圖1 不同濃度過(guò)氧化氫對(duì)莖瘤芥種子發(fā)芽率的影響

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度過(guò)氧化氫對(duì)莖瘤芥種子萌發(fā)的影響

①發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)的變化 a.采用不同濃度的過(guò)氧化氫浸種處理3個(gè)品種的莖瘤芥種子，隨著過(guò)氧化氫濃度的不斷增加，3個(gè)品種的種子發(fā)芽率均先升高后降低，0.01%～0.1%濃度的過(guò)氧化氫處理種子，可以使其發(fā)芽率升高，當(dāng)濃度為0.1%時(shí)，發(fā)芽率達(dá)到最高值；0.1%以上濃度的過(guò)氧化氫明顯抑制種子的萌發(fā)，降低種子的發(fā)芽率。b.3個(gè)品種的種子，與對(duì)照相比，經(jīng)不同濃度過(guò)氧化氫浸種處理后，涪陵早豐種子的發(fā)芽率最大增幅為21個(gè)百分點(diǎn)，永安小葉種子的發(fā)芽率最大增幅為17個(gè)百分點(diǎn)，而鵝公雪松種子的發(fā)芽率最大增幅為10個(gè)百分點(diǎn)，說(shuō)明過(guò)氧化氫浸種對(duì)提高涪陵早豐種子的發(fā)芽率效果最佳（圖1）。

不同濃度的過(guò)氧化氫對(duì)莖瘤芥種子發(fā)芽指數(shù)的影響和對(duì)發(fā)芽率的影響基本一致（圖1，圖2）。

②發(fā)芽率高峰值和活力指數(shù)的變化 從圖3可以看出，a.隨著過(guò)氧化氫處理的濃度不斷提高，3個(gè)品種的種子發(fā)芽率高峰值先升高后降低，0.01%～0.1%濃度的過(guò)氧化氫處理種子，可以使種子發(fā)芽率高峰值升高，當(dāng)濃度為0.1%時(shí)，發(fā)芽率高峰值達(dá)到最高；而0.1%以上濃度的過(guò)氧化氫明顯降低了種子的發(fā)芽率高峰值。b.3個(gè)品種的種子，與對(duì)照相比，經(jīng)不同濃度過(guò)氧化氫浸種處理后，涪陵早豐種子的發(fā)芽率高峰值最大增幅為9個(gè)百分點(diǎn)，永安小葉為7個(gè)百分點(diǎn)，而鵝公雪松為8個(gè)百分點(diǎn)，這表明過(guò)氧化氫浸種對(duì)提高涪陵早豐種子的發(fā)芽率高峰值效果最佳。

圖2 不同濃度過(guò)氧化氫對(duì)莖瘤芥種子發(fā)芽指數(shù)的影響

從圖4可以看出：a.隨著過(guò)氧化氫處理濃度的不斷升高，3個(gè)品種的種子活力指數(shù)先升高后降低，0.01%～0.1%濃度的過(guò)氧化氫可以提高莖瘤芥種子的活力指數(shù)，當(dāng)濃度為0.1%時(shí)，其活力指數(shù)達(dá)到最高值；而過(guò)氧化氫濃度超過(guò)0.1%時(shí)則開(kāi)始降低種子的活力指數(shù)。b.3個(gè)品種的種子，與對(duì)照相比，經(jīng)不同濃度過(guò)氧化氫浸種處理后，涪陵早豐種子的活力指數(shù)最大增幅為127%、永安小葉為74%、而鵝公雪松種子的活力指數(shù)最大增幅為76%，這表明過(guò)氧化氫浸種對(duì)提高涪陵早豐種子的活力指數(shù)效果最佳。

綜上所述，0.1%的過(guò)氧化氫處理的種子，其發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽高峰值以及活力指數(shù)均最高，這表明，0.1%的過(guò)氧化氫對(duì)提高種子活力具有一定作用。3個(gè)品種的種子，經(jīng)過(guò)氧化氫浸種之后，涪陵早豐種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率高峰值和活力指數(shù)增幅均最大，這表明過(guò)氧化氫浸種對(duì)提高涪陵早豐種子活力效果最好。

圖3 過(guò)氧化氫對(duì)莖瘤芥種子發(fā)芽率高峰值的影響

圖4 過(guò)氧化氫對(duì)莖瘤芥種子活力指數(shù)的影響

圖5 過(guò)氧化氫對(duì)莖瘤芥種子電解質(zhì)外滲率的影響

圖6 過(guò)氧化氫對(duì)莖瘤芥種子萌發(fā)期POD活性的影響

2.2 不同濃度過(guò)氧化氫對(duì)莖瘤芥種子電解質(zhì)外滲率的影響

從圖5可以看出，隨著過(guò)氧化氫處理的濃度不斷升高，3個(gè)品種的種子電解質(zhì)滲透率逐漸升高，這表明過(guò)氧化氫可以腐蝕和軟化種皮，增加種皮的通透性，軟化和通透性增加的種皮，不僅有利于萌發(fā)代謝時(shí)的水分、氧氣和二氧化碳的吸收交換，更有助于胚芽破皮萌發(fā)。

2.3 不同濃度過(guò)氧化氫對(duì)莖瘤芥種子萌發(fā)期POD活性的影響

從圖6可以看出，隨著過(guò)氧化氫處理的濃度不斷提高，3個(gè)品種的種子萌發(fā)期的POD活性先升高后降低，0.01%～0.1%的過(guò)氧化氫處理種子，可以使種子萌發(fā)芽的POD活性升高，當(dāng)濃度為 0.1%時(shí)，其POD活性達(dá)到最高；當(dāng)處理濃度超過(guò)0.1%時(shí)，POD活性逐漸降低。

2.4 不同濃度過(guò)氧化氫對(duì)莖瘤芥種子萌發(fā)期PPO活性的影響

從表1可以看出，隨著過(guò)氧化氫處理的濃度不斷提高，3個(gè)品種的種子萌發(fā)期的PPO活性先升高后降低，0.01%的過(guò)氧化氫處理的種子，其PPO活性最高；當(dāng)處理濃度超過(guò)0.01%時(shí)，PPO活性逐漸降低。

表1 不同濃度H2O2對(duì)莖瘤芥種子多酚氧化酶活性的影響

綜上所述，一定濃度的過(guò)氧化氫浸種不僅可以提高種子的發(fā)芽率和活力指數(shù)，還可提高一些相關(guān)酶的活性。分析其原因認(rèn)為，這是一個(gè)由內(nèi)到外的表現(xiàn)過(guò)程，當(dāng)種子機(jī)體內(nèi)的酶活性提高和代謝加強(qiáng)時(shí)，外在就表現(xiàn)出發(fā)芽率和活力指數(shù)相應(yīng)的升高。

表2 莖瘤芥種子活力指數(shù)與其酶活性的相關(guān)系數(shù)

2.5 莖瘤芥種子活力指數(shù)與其POD和PPO活性的相關(guān)性

由表2可以看出，莖瘤芥種子活力指數(shù)與 POD活性相關(guān)系數(shù)較大，呈顯著的正相關(guān)（r=0.862 1），其中POD活性可能是決定種子活力大小的主要因素之一。

3 結(jié)論

①0.1%的過(guò)氧化氫處理的種子，其發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率高峰值以及活力指數(shù)均最高，這表明，0.1%的過(guò)氧化氫對(duì)提高種子活力具有一定作用。

②3個(gè)品種的種子，經(jīng)過(guò)氧化氫浸種之后，涪陵早豐種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率高峰值和活力指數(shù)增幅均最大，這表明過(guò)氧化氫浸種對(duì)提高涪陵早豐種子活力效果最好。

③0.01%過(guò)氧化氫處理的種子，其多酚氧化酶活性最高；0.1%過(guò)氧化氫處理的種子，其過(guò)氧化物酶活性最高。這表明適宜濃度的過(guò)氧化氫浸種可以提高種子的相關(guān)酶活性。

4 討論

過(guò)氧化氫在適當(dāng)濃度下具有促進(jìn)作物種子萌發(fā)的作用。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為它可輕度腐蝕種（果）皮，提高其透性，為種子提供充足的氧氣而解除休眠[9]。但徐是雄等[10]指出，過(guò)氧化氫主要是刺激胚乳物質(zhì)代謝-磷酸戊糖途徑，它對(duì)解除種子休眠具有重要作用。通過(guò)本文的研究表明，一定濃度過(guò)氧化氫不僅促進(jìn)種子的萌發(fā)，提高其活力指數(shù)，還提高種子物質(zhì)代謝水平上相關(guān)酶活性，因此可認(rèn)為，過(guò)氧化氫促進(jìn)種子萌發(fā)與物質(zhì)代謝密切相關(guān)。

適宜濃度過(guò)氧化氫浸種處理的莖瘤芥種子，其發(fā)芽率和過(guò)氧化物酶、多酚氧化酶活性明顯高于對(duì)照處理，表明種子的物質(zhì)代謝水平由于受到過(guò)氧化氫刺激而發(fā)生改變。代謝的改變調(diào)節(jié)主要在4個(gè)水平上進(jìn)行：細(xì)胞水平、酶水平、激素水平和神經(jīng)水平，其中酶水平的調(diào)節(jié)是所有生物最基本的調(diào)節(jié)。酶水平的調(diào)節(jié)又包括酶活和酶量的調(diào)節(jié)，本文認(rèn)為，過(guò)氧化氫浸種提高種子萌發(fā)期的酶活性屬于酶含量的調(diào)節(jié)，但也不排除屬于酶活性調(diào)節(jié)的可能性。過(guò)氧化氫作為氧化劑，它可直接調(diào)控蛋白激酶及磷酸酯酶的活性[11～12]，并可以與DNA上的反應(yīng)元件直接相互作用，這樣便可以選擇誘導(dǎo)許多相關(guān)基因的表達(dá)，從而可以增加酶含量，以提高自身的免疫能力以及代謝水平，代謝得到提高和加強(qiáng)，種子中的貯藏物質(zhì)加快轉(zhuǎn)化為簡(jiǎn)單的化合物運(yùn)輸?shù)秸谏L(zhǎng)的幼苗中，提供幼苗生長(zhǎng)需要的物質(zhì)和能源。物質(zhì)轉(zhuǎn)化率越高對(duì)幼苗的生長(zhǎng)越有利，并可以提高幼苗抗逆性[6]，所以外在表現(xiàn)出種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)以及相關(guān)酶的活力得到提高。

任何代謝水平的調(diào)節(jié)，都必須作用于細(xì)胞并通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)而發(fā)揮作用，過(guò)氧化氫作為植物中可能存在的新的信號(hào)分子，是否以第一信使和第二信使2種形式同時(shí)存在，是一個(gè)令人感興趣的問(wèn)題[6]，所以過(guò)氧化氫對(duì)種子萌發(fā)、活力的提高機(jī)理還有待進(jìn)一步研究和探討。

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