李 霞 閻秀峰

(吉林師范大學(xué)，四平，136000) (東北林業(yè)大學(xué))

氮素在植物營養(yǎng)生理中有很重要的作用，供氮水平可通過影響氮代謝關(guān)鍵酶活性而影響植物的生長、發(fā)育以及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)［1－3］。氮素供應(yīng)水平對(duì)植物體內(nèi)的硝酸還原酶(NR)和谷氨酰胺合成酶(GS)活性有不同程度的影響;也在一定程度上影響可溶性蛋白含量，而可溶性蛋白大部分為參與各種代謝的酶類，是植物體內(nèi)貯藏氮的主要形式，其中絕大多數(shù)是卡爾文循環(huán)中最關(guān)鍵的酶，在植物的光合作用、生長發(fā)育及植物生物量的建成中起著重要作用［2－3］。黃檗(Phellodendron amurense)為蕓香科(Rutaceae)黃檗屬(Phellodendron)植物，是東北闊葉紅松林的重要伴生樹種，也是我國名貴中藥黃柏的藥源植物，其內(nèi)皮(韌皮部)入藥，稱為關(guān)黃柏。近年來，筆者就黃檗中主要生物堿的分布規(guī)律和部分環(huán)境因子對(duì)黃檗中主要生物堿含量的影響、氮素形態(tài)對(duì)黃檗幼苗主要生物堿及氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響等作了一些研究工作［4－6］。研究了不同氮素水平對(duì)當(dāng)年生黃檗幼苗葉片中氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響，為明確氮素對(duì)黃檗生長及一些生理過程的影響，確定黃檗生長所需的最佳氮素條件，以便進(jìn)一步探討黃檗生長與主要藥用成分含量均佳的氮肥管理與調(diào)控。

1 材料與方法

黃檗幼苗在陽光溫室內(nèi)培養(yǎng)，溫室為自然采光，溫度控制在18～30℃，水培容器為長50 cm、寬37 cm、高13 cm的塑料盆，上覆具孔泡沫板用于黃檗幼苗的固定。從苗圃選取生長一致的1年生黃檗幼苗，先以自來水培養(yǎng)2d，再澆灌氮素濃度為8 mmol/L的正常營養(yǎng)液，以使幼苗生長健壯。完全營養(yǎng)液主要按Ultriainen等［7］方法配制，但略加修改:NH4NO34 mmol/L、KH2PO41 mmol/L、KC1 1 mmol/L、CaCl2－6H2O 1 mmol/L、MgSO4－7H2O 0.6 mmol/L、FeCl3－6H2O 0.02 mmol/L、MnCl2－4H2O 6 μmol/L、H3BO30.016 mmol/L、ZnCl20.3 μmol/L、CuCl2－2H2O 0.3 μmol/L、Na2MoO4－2H2O 0.3 μmol/L。在完全營養(yǎng)液基礎(chǔ)上，通過改變NH4NO3的量調(diào)配出5種營養(yǎng)水平的氮素處理液，既1、4、8、16和32 mmol/L。每天用0.1 mmol/L的KOH和HCl將營養(yǎng)液pH值調(diào)至6.0左右。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，營養(yǎng)液3 d更換1次，全天用泵通氣，并相應(yīng)地補(bǔ)充損失的水分。

處理后每隔10 d分別采集黃檗幼苗頂端完全展開的第1片成熟葉片，并進(jìn)行各項(xiàng)生理指標(biāo)的測(cè)定，每重復(fù)5株。硝態(tài)氮和銨態(tài)氮測(cè)定參照Richardson［8］方法，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮蘭比色法測(cè)定［9］，NR 的測(cè)定采用活體法［10－11］，GS的測(cè)定參照Miflin［12］的方法，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定吸光值。處理后第50天，測(cè)量黃檗幼苗的株高、莖直徑(基部)、單株生物量，并重復(fù)8株。所得數(shù)據(jù)用SAS 8.1 for Windows進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用方差分析檢驗(yàn)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮素濃度對(duì)黃檗幼苗生長的影響

氮素濃度不同對(duì)黃檗幼苗的生長影響明顯。表1是處理結(jié)束時(shí)(第50天)黃檗幼苗的生長狀況?？梢钥闯?，隨著營養(yǎng)液氮素濃度的升高，黃檗幼苗的株高、莖直徑和全株生物量逐漸升高，16 mmol/L處理達(dá)到最大值，當(dāng)?shù)貪舛壬叩?2 mmol/L時(shí)，株高、莖直徑和全株生物量都比16 mmol/L時(shí)的最大值略有下降，但兩者差異不顯著。氮素濃度為16 mmol/L時(shí)黃檗幼苗的生長狀況最好，而氮素濃度為1 mmol/L時(shí)，黃檗幼苗的生長狀況最差。

表1 不同氮素濃度下黃檗幼苗的生長狀況

2.2 氮素濃度對(duì)黃檗幼苗葉片中銨態(tài)氮、硝態(tài)氮及可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

隨著處理時(shí)間的延長，氮素濃度較高的16和32 mmol/L 2個(gè)處理銨態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)略高于其他處理，而這2個(gè)處理間無明顯差異;1和4 mmol/L 2個(gè)處理隨著處理時(shí)間增加銨態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯下降;8 mmol/L處理銨態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不大，只在后期略有增加。在處理第50天，氮素濃度較高的處理銨態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較高，但不是完全的對(duì)應(yīng)關(guān)系(表2)。在氮素處理20 d時(shí)，各處理黃檗幼苗葉片中硝態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)都有升高的趨勢(shì)，然后逐漸下降趨于穩(wěn)定。從處理第30天后測(cè)定的結(jié)果表明，培養(yǎng)液氮素濃度增加，硝態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)有升高的趨勢(shì)，在16和32 mmol/L 2個(gè)處理硝態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯高于1、4和8 mmol/L 3個(gè)處理，但兩者之間差異不顯著，1、4和8 mmol/L 3個(gè)處理間差異也不顯著，見表2所示。可見，培養(yǎng)液氮素濃度的變化不同程度地影響了黃檗幼苗中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，總體看，雖然不是完全的對(duì)應(yīng)關(guān)系，但基本上是氮素濃度升高，葉片中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也較高。

在處理的前20 d，氮素濃度對(duì)黃檗幼苗葉片中可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響不明顯，從處理的30d后，氮素濃度為8、16和32 mmol/L的3個(gè)處理，可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高幅度較大，在處理后期，16和32 mmol/L的2個(gè)處理明顯高于其他處理，但兩者之間無顯著差異;其他3個(gè)處理是氮素濃度越高，可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高?？梢姡貪舛壬咴谝欢ǔ潭壬峡商岣唿S檗幼苗葉片中可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，但當(dāng)升高到一定程度時(shí)，可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)不會(huì)繼續(xù)升高，見表2。

表2 不同氮素濃度下黃檗幼苗葉片銨態(tài)氮和硝態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.3 氮素濃度對(duì)黃檗幼苗葉片中NR和GS活性的影響

由表3可見，在處理的最初階段，氮素濃度對(duì)黃檗幼苗葉片中NR的影響較大，各處理間的差異較大，表現(xiàn)為氮素濃度越高NR活性越強(qiáng)。在處理的20 d后，8、16和32 mmol/L的3個(gè)處理NR活性波動(dòng)較小，在處理后期都略有下降，3者差異不明顯。1、4 mmol/L 2個(gè)處理NR活性波動(dòng)較大，且都明顯低于其他3個(gè)處理，兩者差異不顯著。氮素濃度對(duì)GS活性的影響與NR比較相似，在整個(gè)氮素處理的過程中，基本上是氮素濃度越高，GS活性越強(qiáng)，但不完全對(duì)應(yīng)，比較顯著的特征是8、16和32 mmol/L 3個(gè)處理GS活性比較相似，顯著高于1、4 mmol/L這2個(gè)處理，而3者之間差異不顯著，1、4 mmol/L 2個(gè)處理之間差異也不顯著，見表3所示。

總體看，氮素濃度升高，可在一定程度上提高中NR和GS的活性。

表3 不同氮素濃度下黃檗幼苗葉片NR和GS活性

3 結(jié)論與討論

氮素作為重要的營養(yǎng)因子對(duì)樹木生物量的限制作用尤為明顯?？扇苄缘鞍状蟛糠譃閰⑴c各種代謝的酶類，是植物體內(nèi)貯藏氮的主要形式，供氮水平可在一定程度上影響可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，進(jìn)而反映供氮對(duì)植物生長發(fā)育和代謝的影響。從本文的結(jié)果來看，1 mmol/L處理可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，且生物量也最低，說明缺氮可能導(dǎo)致氮素同化能力減弱，光合產(chǎn)物流向氮素代謝、用于NH3同化為氨基酸和蛋白質(zhì)的相對(duì)較少。16和32 mmol/L的2個(gè)處理可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯高于其他處理，但兩者無明顯差異，這也與生物量的變化相同，說明隨著氮素水平的增加和氮素同化能力的增加，越來越多的光合產(chǎn)物流向氮素代謝，因而葉片中可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加。但由于黃檗幼苗的氮素同化能力有限，過量的供氮可能引發(fā)營養(yǎng)失衡，根系為抵御高氮脅迫，必須提高呼吸強(qiáng)度來盡量適應(yīng)旱育環(huán)境，引起細(xì)胞早衰，生長受到嚴(yán)重限制，最終造成膜傷害［13］。所以只有供氮水平適宜，才能最大限度提高氮素利用率。

植物獲取氮素營養(yǎng)包括吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和同化3個(gè)主要過程，即 NO－3和 NH+4的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)、NO－3被 NR 還原為 NH+4，NH+4被谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合酶(GS/GOGAT)同化為谷氨酸和谷氨酰胺，NR是一種誘導(dǎo)酶，為硝態(tài)氮同化的限速酶，其活性取決于介質(zhì)中的NO－3濃度。在一定范圍內(nèi)，植物體內(nèi)的NO－3濃度與NR的活性呈正相關(guān)，且NR只有在NO－3溶液中經(jīng)過一段時(shí)間的誘導(dǎo)才能逐步形成。近年也有研究表明，即使同一物種，不同品種間的NR活性并非只受硝態(tài)氮的激活。中筋小麥豫麥49在施用銨態(tài)氮時(shí)，GS和GOGAT活性增強(qiáng)的同時(shí)，NR活性也有較大增強(qiáng)［14］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，黃檗葉片中NR活性明顯受供氮水平高低的影響，營養(yǎng)液供氮水平的提高，葉片中NR活性增加，并表現(xiàn)出了與黃檗葉片中硝態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)相似的變化趨勢(shì)，從而再度證明，谷氨酰胺合成酶(GS)是NH+4同化過程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，參與多種氮代謝的調(diào)節(jié)，是氮代謝中心的多功能酶。目前，尚不清楚對(duì)GS基因表達(dá)及活性起刺激信號(hào)的作用是NO－3還是其同化產(chǎn)物。

［1］ 張福鎖，樊小林，李曉林.土壤與植物營養(yǎng)研究新動(dòng)態(tài):第2卷［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1995:42－69.

［2］ Inokuchi R，Kuma K，Miyata T，et al.Nitrogen-assimilating enzymes in land plants and algae phylogenic and physiological perspectives［J］.Physiol Plantarum，2002，116:1－11.

［3］ Wang Y H，Garvin D F，Kochian L V.Nitrate-induced genes in tomato roots.Array analysis reveals novel genes that may play a role in nitrogen nutrition［J］.Plant Physiol，2001，127:345－359.

［4］ 李霞，劉劍鋒，閻秀峰.氮素形態(tài)對(duì)黃檗幼苗三種生物堿含量的影響［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2005，25(9):2159－2164.

［5］ 李霞，閻秀峰，劉劍鋒.氮素形態(tài)對(duì)黃檗幼苗生長、氮代謝相關(guān)酶類的影響［J］.植物學(xué)通報(bào)，2006，23(3):255－261.

［6］ 李霞，楊立學(xué)，閻秀峰.一年生黃檗幼苗藥用生物堿的分布及其含量變化［J］.東北師大學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2006，38(2):101－104.

［7］ Ultriainen J，Holopainen T.Nitrogen availability modifies the ozone responses of Scots pine seedlings exposed in an open-field system［J］.Tree Physiol，2001，21:1205－1213.

［8］ Richardson M，Cabrera R I，Murphy J A，et al.Nitrogen-form and endophyte-infection effects on growth，nitrogen uptake and alkaloid content of chewings fescue turfgrass［J］.J Plant Nutr，1999，22:67－79.

［9］ Baricevic D，Umek A，Kreft S，et al.Effect of water stress and nitrogen fertilization on the content of hyoscyamine and scopolamine in the roots of deadly nightshade(Atropa belladonna)［J］.Environ Exp Bot，1999，42:17－24.

［10］ 張志良，瞿偉菁.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.北京:高等教育出版社，2003:41－67.

［11］ 周樹，鄭相穆.NR體內(nèi)分析方法的探討［J］.植物生理學(xué)通訊，1985(1):47－49.

［12］ Miflin B J，Lea P J.Ammonia metabolism［J］.Annual Review of Plant Physiology，1977，28:288－329.

［13］ 王強(qiáng)盛，丁艷鋒，嚴(yán)定春，等.不同施氮量對(duì)水稻旱育秧苗形態(tài)特征和生理特性的影響［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27(3):11－14.

［14］ 王小純，熊淑萍，馬新明，等.不同形態(tài)氮素對(duì)專用型小麥花后氮代謝關(guān)鍵酶活性及籽粒蛋白質(zhì)含量的影響［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2005，25(4):802－807.