黃群蓮，鄧以平，徐紹友(1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，瀘州市646000；.四川寶光藥業(yè)股份有限公司，瀘州市646100)

氧氟沙星(Ofloxacin，OFLX)又名氟嗪酸，是第3代喹諾酮抗菌藥，由于分子結(jié)構(gòu)中具有疏水性的N-甲基哌嗪環(huán)以及親水性的嗪環(huán)，同時(shí)6位C原子上氟原子的引入，使得該藥物具有良好的組織滲透性。其對革蘭陽性和陰性菌、大腸桿菌、葡萄球菌和肺炎球菌均有強(qiáng)的抗菌活性[1]，與早期的喹諾酮類藥物相比，具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)，低毒、高效、副作用小等特點(diǎn)[2]，因此臨床上主要用于淋病、尿路感染、呼吸道感染以及胃腸道感染的治療。

酸堿性是藥物重要的理化性質(zhì)，同時(shí)該性質(zhì)與藥物在體內(nèi)的吸收、分布和溶解度密切相關(guān)，而解離常數(shù)(pKa)是與藥物溶解度和pH值有關(guān)的理化常數(shù)，藥物解離常數(shù)的測定可為在分子水平上研究藥物的吸收與受體結(jié)合提供重要的信息[3]，同時(shí)也在藥物新劑型和新配方的研制中具有重要的指導(dǎo)意義[4]。

測定解離常數(shù)的方法目前主要有電位滴定法[5]、電導(dǎo)率法[6]、熒光法[7]、電泳法[8]以及紫外分光光度法[9]等。由于紫外分光光度法具有操作簡單、快速、精密度高、重現(xiàn)性好、數(shù)據(jù)處理方便等特點(diǎn)，特別適合于一元弱酸(堿)性藥物解離常數(shù)的測定。通過對氧氟沙星在不同pH值緩沖溶液中進(jìn)行紫外吸收掃描，發(fā)現(xiàn)在293 nm波長處存在最大紫外吸收，故本文采用紫外分光光度法測定氧氟沙星的2個(gè)解離常數(shù)。氧氟沙星的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 氧氟沙星的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 1The molecular structure of ofloxacin

1 材料

1.1 儀器

UV-2550型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)；PHS-P1型酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠)；FA2104電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥

氧氟沙星(臺州市新星醫(yī)藥化工有限公司，批號:20100230，純度:99.12%)；氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所，批號:20891006，供含量測定用)；醋酸、醋酸鈉、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷、氫氧化鈉、硼砂均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 氧氟沙星解離常數(shù)測定的基本原理

氧氟沙星中由于羧基與氨基的存在，因此在不同pH值的范圍內(nèi)應(yīng)存在不同的電離形式。通過對其在不同pH值緩沖溶液中進(jìn)行紫外吸收掃描，發(fā)現(xiàn)pH值在3.16以下，6.96～7.22及9.12以上時(shí)，其分別以酸性(AA+)、中性(AA0)和堿性(AA-)的形式存在，而在3.16～6.96和7.22～9.12則分別以酸性(AA+)和中性(AA0)、中性(AA0)和堿性(AA-)的形式共存。氧氟沙星在不同pH值溶液中的解離形式如圖2所示。

圖2 氧氟沙星在不同pH值溶液中的解離形式Fig 2The dissociation forms of ofloxacin in solutions with different pH values

設(shè)在25℃的環(huán)境中測定解離常數(shù)pKa，用1.0 cm的吸收池，在特定波長處測得吸光度為A，對任意pH值的緩沖溶液樣品，則根據(jù)吸光度的加和原理，可得氧氟沙星在酸性(式(1))和堿性(式(2))時(shí)解離常數(shù)的計(jì)算公式:

根據(jù)公式(1)和(2)，只要測出AAA+、AAA0及不同pH值下的吸光度A，分別以lg([AAA+－A)(/A－AAA)0]或lg([AAA0－A)/(A－AAA-)]為橫坐標(biāo)，pH值為縱坐標(biāo)作圖得一直線，縱坐標(biāo)上的截距就是氧氟沙星的2個(gè)解離常數(shù)pKa。

2.2 試液的制備

氧氟沙星溶液:稱取0.1345 g的氧氟沙星，醋酸溶解并定容于250 mL的容量瓶中，得到濃度為1.50×10－3mol·L－1的氧氟沙星醋酸溶液。

緩沖溶液:將0.1 mol·L－1的醋酸鈉與0.1 mol·L－1的鹽酸或0.1 mol·L－1的醋酸按不同的比例混合，以及0.1 mol·L－1的三羥甲基氨基甲烷與0.1 mol·L－1的鹽酸按不同的比例混合，制備成pH值為2.87～8.12的一系列緩沖溶液；將0.025 mol·L－1硼砂與0.1 mol·L－1的鹽酸或者氫氧化鈉溶液按不同比例混合，制備成pH值為8.48～10.20的一系列緩沖溶液。

2.3 測定條件的選擇

分別制備2%的醋酸溶液和1.50×10－7mol·L－1(1.50×10－3mol·L－1的氧氟沙星醋酸溶液0.5 mL稀釋至50 mL)的氧氟沙星醋酸溶液50 mL，分別以蒸餾水和醋酸作參比，用紫外分光光度計(jì)在200～400 nm波長范圍掃描，得到醋酸和氧氟沙星的紫外吸收光譜，見圖3。

從圖3A可以看出，醋酸在288 nm波長處為醋酸酯羰基的最大紫外吸收，而約在285 nm波長以上則無紫外吸收，在205 nm波長處的強(qiáng)吸收為溶劑水的羥基吸收。對比圖3B可以看出，在293.5 nm波長處氧氟沙星有1個(gè)明顯的最大紫外吸收，這是氧氟沙星的分子結(jié)構(gòu)中α，β-不飽和羰基的紫外吸收；同時(shí)氧氟沙星溶液在330 nm波長左右有1個(gè)弱吸收，這是氧氟沙星分子結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)與α，β-不飽和羰基中的雙鍵共軛所引起的弱紫外吸收；而265 nm波長以下為醋酸酯羰基所引起的紫外吸收，對氧氟沙星在293.5 nm波長處的最大紫外吸收沒有影響。因此選擇醋酸作為氧氟沙星的溶劑，不影響其測定結(jié)果。

2.4 含量測定方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。根據(jù)《中國藥典》2005年版二部附錄中“藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”，取氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱定，用醋酸溶解制備成2.5013、3.7855、5.0152、6.3245、7.5866、8.8542、10.1106 μg·mL－1的氧氟沙星醋酸溶液，在293.5 nm波長處測得吸光度分別為0.232、0.341、0.446、0.552、0.672、0.774、0.882。以各梯度溶液濃度(C，μg·mL－1)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程:A＝0.0856C+0.0168(R2＝0.9998)，表明氧氟沙星檢測濃度線性范圍為2.5013～10.1106 μg·mL－1。

2.4.2 精密度試驗(yàn)。取氧氟沙星醋酸溶液(3.7855 μg·mL－1)，重復(fù)測定其吸光度6次，其RSD＝0.22%(n＝6)。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取氧氟沙星醋酸溶液(3.7855 μg·mL－1)，分別在0、2、4、8、16、24 h測定其吸光度，結(jié)果其RSD＝1.21%(n＝6)，表明溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.4 加樣回收率試驗(yàn)。取已知氧氟沙星含量的樣品的醋酸溶液50 mL，共6份，分別在其中精密加入一定量的氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品，依法測定，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1Results of recovery test

2.5 氧氟沙星pKa的粗測

在25℃的條件下，將氧氟沙星與鹽酸按照1∶1的摩爾比例混合，在水中反應(yīng)完全后制備成1.50×10－5mol·L－1的氧氟沙星溶液，由于反應(yīng)完全后[AA+]＝[AA0]，此時(shí)pKa1≈pH；同理，將氧氟沙星與氫氧化鈉按照1∶1的摩爾比例混合，在水中反應(yīng)制備成1.50×10－5mol·L－1的氧氟沙星溶液，由于反應(yīng)完全后[AA0]＝[AA-]，此時(shí)pKa2≈pH。分別用酸度計(jì)測得以上2個(gè)反應(yīng)液的pH值，即得氧氟沙星粗測的pKa值，粗測得pKa1＝5.68，pKa2＝8.32。

2.6 氧氟沙星pKa1、pKa2的作圖計(jì)算

取16只50 mL的容量瓶，各加入1.50×10－3mol·L－1的氧氟沙星醋酸溶液0.5 mL，分別用不同pH值(2.87、3.16、4.48、4.98、5.62、6.15、6.86、6.96、7.22、7.72、8.12、8.68、8.90、9.20、9.32、10.20)的緩沖溶液定容及作參比，在25℃的室溫下于293.5 nm波長處測定不同pH值下氧氟沙星溶液的吸光度，每個(gè)樣品平行測定3次，取其平均值，結(jié)果見表2。

表2 氧氟沙星在不同pH值緩沖溶液中的吸光度(25℃)Tab 2The absorbance values of ofloxacin in buffer solutions with different pH values(25℃)

從表2可以看出，氧氟沙星的吸光度與緩沖溶液的pH值有關(guān)。相同濃度的氧氟沙星在pH 6.86以下的溶液中，隨著pH值的增大，吸光度逐漸減小，這是因?yàn)樽贤夤庾V與n電子和π電子的躍遷有關(guān)。當(dāng)pH值增大時(shí)，即氧氟沙星的羧基電離后，使得羧基中氧上的n電子與π電子的共軛程度增加，降低了n電子和π電子躍遷的幾率，使得吸收強(qiáng)度減小，因此吸光度降低。相同濃度的氧氟沙星在pH 7.22以上的溶液中，吸光度隨著pH值增大而增大，由于在高pH值下分子中的叔胺基電離出的H+離子被堿中和后，羧基與堿中的陽離子成鹽后，相反降低了羧基中氧上的n電子與π電子的共軛程度，因此增加了n電子和π電子躍遷的幾率，使得吸收強(qiáng)度增加，導(dǎo)致吸光度增大。

從表2中還可以看出，在pH值小于3.16的緩沖溶液中，吸光度恒定，即氧氟沙星全部以質(zhì)子化(即AA+)的形式存在，此時(shí)AAA+＝0.496；pH值在6.96～7.22之間時(shí)主要以氧氟沙星分子(即AA0)形式存在，此時(shí)AAA0＝0.409；pH值大于9.32時(shí)全部以完全去質(zhì)子化(即AA-)的形式存在，此時(shí)AAA-＝0.512。根據(jù)式(1)和(2)，在不同pH值下分別以lg[(AAA+－A)/(A－AAA0)]和lg[(AAA0－A)/(A－AAA-)]為橫坐標(biāo)(用x表示)，pH值為縱坐標(biāo)(用y表示)作圖，見圖4。

通過作圖得氧氟沙星在酸、堿性緩沖溶液中的線性方程分別為y＝2.0796x+5.7677(R2＝0.9902)、y＝0.8008x+8.4359(R2＝0.9932)。相關(guān)系數(shù)R2分別為0.9902和0.9932，表明線性擬合后近似于直線；由截距可知，氧氟沙星的解離常數(shù)pKa1約為5.77、pKa2約為8.44，與粗測值相比，相對誤差分別為1.56%和1.44%。

3 討論

氧氟沙星在水中溶解度較差，需成鹽后才溶解。本文以醋酸作溶劑，用紫外分光光度計(jì)測得氧氟沙星在293.5 nm波長處有最大紫外吸收，而在265 nm波長以下，醋酸對氧氟沙星的最大吸收沒有影響，因此選擇293.5 nm的波長作為氧氟沙星定性定量分析的測定波長。

通過作圖法求得氧氟沙星的2個(gè)解離常數(shù):pKa1為5.77，pKa2為8.44。對解離常數(shù)的測定，關(guān)鍵是選擇適宜pH值范圍的緩沖溶液，以保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

綜上所述，該方法簡便、快速，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。氧氟沙星2個(gè)解離常數(shù)的測定對進(jìn)一步研究其在生物體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄的規(guī)律以及對該藥物的制備工藝的篩選、制劑分析等方面提供了基礎(chǔ)性的理論研究數(shù)據(jù)。

[1]王劍，劉忠芳，劉紹璞.銅(Ⅱ)-氟喹諾酮類抗生素螯合物與赤蘚紅體系的吸收、熒光和共振Rayleigh散射光譜及其分析應(yīng)用研究[J].中國科學(xué)B輯:化學(xué)，2007，37(5):453.

[2]莫慧貞，李靜.HPLC法測定氧氟沙星膠囊中氧氟沙星的含量[J].廣東藥學(xué)，2005，15(6):10.

[3]陳金蓉，劉家琴，羅英，等.大豆黃素解離常數(shù)的分光光度法測定[J].綿陽師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，27(2):64.

[4]李廣領(lǐng)，張育平.水楊酸pKa的紫外-可見分光光度法測定[J].河南科技學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2005，33(1):75.

[5]朱志良，梁曉明，張榮華.聚天冬氨酸酸解離常數(shù)的測定[J].分析化學(xué)研究簡報(bào)，2005，33(12):1722.

[6]凌小紅.電導(dǎo)(率)法測定醋酸解離常數(shù)的數(shù)據(jù)處理方法研究——Excel的應(yīng)用[J].首都師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2006，27(4):39.

[7]李俊，張冬梅，陶力.熒光法測定核黃蛋白-核黃素的解離常數(shù)[J].大學(xué)化學(xué)，2000，15(3):39.

[8]馮海清，傅崇崗.毛細(xì)管電泳電化學(xué)檢測法同時(shí)測定3種氨基酸的電離常數(shù)[J].分析試驗(yàn)室，2006，25(8):21.

[9]劉西京，楊大堅(jiān)，羅杰英，等.紫外分光光度法測定葛根素的解離常數(shù)[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2006，17(11):2206.