王 剛，韓敦富，施彥璋，陳志維，李逸群，劉尚禮△

(1佛山市中醫(yī)院骨科，廣東 佛山 528000;2中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科，廣東 廣州 510120;3汕頭市中心醫(yī)院骨科，廣東 汕頭 515031)

源于椎間盤的腰痛仍是目前社會中嚴(yán)重影響人們生活和致殘的常見原因之一[1]，研究表明，傷害感受器神經(jīng)纖維的長入可能是導(dǎo)致椎間盤源性腰痛發(fā)生的基礎(chǔ)[2，3]，神經(jīng)生長因子 (nerve growth factor，NGF)在促進(jìn)神經(jīng)纖維長入椎間盤過程中可能起到了關(guān)鍵作用[4]。研究還發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)－α，白細(xì)胞介素(interleukin，IL)－1β等在退變椎間盤中高表達(dá)[5]，并且可以大大提高椎間盤細(xì)胞分泌 NGF[6，7];進(jìn)一步研究表明，IL－6、IL－8在疼痛的椎間盤高表達(dá)，而TNF－α、IL－1β則表達(dá)較低[8]。因此，我們推測 IL－6、IL－8等在促進(jìn)椎間盤細(xì)胞產(chǎn)生NGF，誘導(dǎo)神經(jīng)長入過程中可能發(fā)揮了更重要的作用。因此，本文目的旨在觀察IL－1β和IL－6對體外培養(yǎng)的人椎間盤髓核細(xì)胞NGF表達(dá)的影響。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 DMEM－F12培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(Hyclone)，IL－1β 及 IL－6(Peprotechec)，Trizol(Invitrogen)，逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng) (reverse transcription polymerase chain reaction，RT－PCR)試劑盒(TaKaRa)，PCR引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，蛋白裂解液 (申能博彩，進(jìn)口分裝)，β －actin、NGF－β 單克隆抗體(Newmarker)，Ⅱ型膠原單克隆抗體(Chemicon)，羊抗兔Ⅱ抗(晶美生物有限公司)，增強化學(xué)發(fā)光液(enhanced chemiluminescence，ECL)(晶美生物有限公司)。

1.2 人髓核細(xì)胞來源 將取自特發(fā)性脊柱側(cè)彎患者的髓核組織標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)，男女各2例，年齡在10－15歲之間，L2/L3節(jié)段2例，L3/L4節(jié)段2例，所取節(jié)段椎間盤術(shù)前MRI顯示Pfirrmann退變分級[8]為 1 級。

2 方法

2.1 髓核細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 前路手術(shù)取出椎間盤組織后立刻裝入50 mL無菌離心管，置于冰盒后即刻送往實驗室。椎間盤組織用冰磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)溶液漂洗3次，分離出中央膠凍樣髓核組織，在DMEM/F12培養(yǎng)基中將其剪成約1 mm×1 mm×1 mm的組織顆粒，1000 r/min離心5 min，去上清液，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基(含青、鏈霉素各1×105U/L)重懸后轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，然后離心去上清，PBS漂洗后，依次用0.25%胰蛋白酶、2%Ⅱ型膠原酶消化后，收集上清液，1000r/min離心 5 min，去除上清液，再加入10 mL含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基吹打均勻后計數(shù)，以3×105cells/cm2濃度轉(zhuǎn)移到6孔培養(yǎng)板或25 cm2培養(yǎng)瓶在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。細(xì)胞貼壁后，每2－3 d換液1次，按時用倒置顯微鏡觀察、拍照。

2.2 髓核細(xì)胞鑒定 制備好細(xì)胞爬片，用新鮮配制的4%多聚甲醛固定20 min。甲苯胺藍(lán)染色觀察細(xì)胞糖胺多糖的分泌能力:將固定好的細(xì)胞爬片，10 g/L甲苯胺藍(lán)室溫染色10 min，光學(xué)顯微鏡觀察拍照。番紅－O染色觀察蛋白多糖的分泌能力:將固定好的細(xì)胞爬片，用1%番紅－O室溫浸染30 min，光鏡下觀察拍照。Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色確定Ⅱ型膠原分泌情況:將固定好的細(xì)胞爬片，3%H2O2甲醇溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶10 min，正常山羊血清室溫封閉20 min，滴加1∶150稀釋的Ⅱ型膠原單克隆抗體，4℃孵育過夜，滴加生物素化Ⅱ抗，37℃孵育20 min，滴加SABC試劑 37℃ 20 min，滴加新鮮配制的DAB顯色劑，鏡下控制顯色。并設(shè)置陰性對照組。沖洗、脫水、封片，光鏡下觀察拍照。

2.3 IL－1β、IL－6和髓核細(xì)胞共培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別設(shè)置對照組和實驗組，更換為含0.3% 胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基，實驗組中分別加入(10 μg/L、50 μg/L)IL－1β、IL－6共培養(yǎng)48 h，分別應(yīng)用免疫組織化學(xué)法、RT－PCR和Western blotting檢測細(xì)胞表達(dá)NGF的情況。

2.4 IL－1β、IL－6和髓核細(xì)胞共培養(yǎng)后 NGF表達(dá)的檢測

①免疫組織化學(xué)法檢測髓核細(xì)胞NGF的表達(dá)情況步驟同Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色。

②RT－PCR檢測髓核細(xì)胞NGF mRNA的表達(dá) 共培養(yǎng)48 h時棄去上清液，加入Trizol提取總RNA，采用TaKaRa PrimeScriptTMRT－PCR kit試劑盒二步法RT－PCR檢測 NGF mRNA的表達(dá)。NGF－β、磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH)上、下游引物序列及產(chǎn)物長度見表1，擴增產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，MacintoshⅡ圖像分析軟件進(jìn)行吸光度掃描分析，以目的條帶吸光度與內(nèi)參照GAPDH吸光度比值表示目的基因表達(dá)水平。

表1 NGF－β、GAPDH上、下游引物序列及產(chǎn)物長度Table1.The primer and the length of NGF and GAPDH

③Western blotting檢測髓核細(xì)胞NGF蛋白表達(dá) 共培養(yǎng)48 h時棄去上清液，加入蛋白裂解液提取總蛋白，制備樣品并配置SDS(sodium－dodecyl sulphate)－PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)凝膠，行SDS－PAGE凝膠電泳，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移聚乙烯二氟

(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜和膜封閉，封閉結(jié)束后，孵育Ⅰ抗4℃過夜(NGF－β和β－actinⅠ抗稀釋度均為1∶1000)，1×PBST洗滌3次，每次5 min，室溫孵育Ⅱ抗(稀釋度1∶1000)1 h。將 ECL發(fā)光試劑涂于PVDF膜上，反應(yīng)1－3 min，置于暗盒中使X光膠片曝光2－30 min，顯影定影，照像留底。用MacintoshⅡ圖像分析系統(tǒng)計算分析條帶的灰度值，用NGF－β與相應(yīng)β－actin條帶值的比值反映β－NGF表達(dá)的變化。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 髓核細(xì)胞鑒定

自髓核組織中分離和培養(yǎng)出的髓核細(xì)胞，可被甲苯胺藍(lán)、番紅－O深染色，具有分泌糖胺多糖和蛋白多糖能力;Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色確定該類型細(xì)胞可分泌Ⅱ型膠原，見圖1。

Figure1.The identification of nucleus pulposus cells(×200).A:the staining of toluidine blue;B:the staining of safranine－O;C:immunocytochemical staining of collagen－II.圖1 髓核細(xì)胞的鑒定

2 髓核細(xì)胞和IL－1β、IL－6共培養(yǎng)后NGF表達(dá)情況

2.1 髓核細(xì)胞NGF表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測 各組中髓核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中均出現(xiàn)彌散的淡黃染色，分別和IL－1β、IL－6共培養(yǎng)后的髓核細(xì)胞彌散的淡黃染色稍增多，見圖2。

2.2 IL－1β、IL－6對髓核細(xì)胞 NGF mRNA 表達(dá)的影響 髓核細(xì)胞分別和不同濃度的IL－1β、IL－6共培養(yǎng)48 h后，提取總RNA行RT－PCR檢測NGF mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示:與對照組比較，10 μg/L、50 μg/L IL－1β組分別上調(diào)了髓核細(xì)胞NGF mRNA的表達(dá)約2.6、2.8 倍，而10 μg/L、50 μg/L IL －6 組分別上調(diào)了約3.6、4.1倍，見圖3、表2。

Figure2.Immunocytochemical staining of NGF in nucleus pulposus cells(×200).A:control;B:stimulated by IL－1β (50 μg/L);C:stimulated by IL －6(50 μg/L).圖2 髓核細(xì)胞NGF免疫組織化學(xué)染色

2.3 IL－1β、IL－6對髓核細(xì)胞 NGF蛋白表達(dá)的影響 共培養(yǎng)48 h后提取總蛋白用Western blotting檢測NGF蛋白表達(dá)結(jié)果顯示:與對照組比較，10 μg/L、50 μg/L IL－1β組分別上調(diào)了髓核細(xì)胞NGF蛋白的表達(dá)約5.4、5.8 倍，而10 μg/L、50 μg/L IL －6 組分別上調(diào)了約7.4、8.0倍，結(jié)果和RT－PCR檢測的NGF mRNA表達(dá)結(jié)果相一致，見圖4、表2。

Figure3.The expression of NGF mRNA in the nucleus pulposus cells after IL－1β or IL－6 stimulation.1:control;2:10 μg/L IL － 1β;3:50 μg/L IL － 1β;4:10 μg/L IL －6;5:50 μg/L IL －6.圖3 IL－1β、IL－6對髓核細(xì)胞NGF mRNA表達(dá)的影響

Figure4.The expression of NGF protein in the nucleus pulposus cells after IL－1β or IL－6 stimulation.1:control;2:10 μg/L IL － 1β;3:50 μg/L IL － 1β;4:10 μg/L IL －6;5:50 μg/L IL －6.圖4 IL－1β、IL－6對髓核細(xì)胞NGF蛋白表達(dá)的影響

表2 IL－1β、IL－6對髓核細(xì)胞NGF mRNA及蛋白表達(dá)的影響Table2.The expression of NGF mRNA and protein in the nucleus pulposus cells after IL－1β or IL－6 stimulation(.n=3)

表2 IL－1β、IL－6對髓核細(xì)胞NGF mRNA及蛋白表達(dá)的影響Table2.The expression of NGF mRNA and protein in the nucleus pulposus cells after IL－1β or IL－6 stimulation(.n=3)

＊＊P ＜0.01 vs control group;△△P ＜0.01 vs IL－1β.

Group NGF mRNA NGF protein Control 1.00 ±0.10 1.00 ±0.20 IL －1β10 μg/L 2.60 ±0.26＊＊ 5.40 ±0.30＊＊IL －1β 50 μg/L 2.80 ±0.25＊＊ 5.80 ±0.28＊＊IL －610 μg/L 3.60 ±0.22＊＊△△ 7.40 ±0.40＊＊△△IL －650 μg/L 4.10 ±0.23＊＊△△ 8.00 ±0.45＊＊△△

討 論

椎間盤為“三明治”結(jié)構(gòu)，上下為軟骨終板，與上下方椎體相連，中間部分的內(nèi)外層分別為髓核和纖維環(huán)。正常人類椎間盤除纖維環(huán)的外1/3存在血管神經(jīng)外基本是一個不含神經(jīng)血管組織，然而研究發(fā)現(xiàn)，在疼痛椎間盤中，微血管伴隨神經(jīng)末梢通過終板長入正常無血管的椎間盤內(nèi)部[2，3]。Peng 等[2]的研究發(fā)現(xiàn)，椎間盤源性腰痛病人椎間盤中，新生的神經(jīng)纖維和毛細(xì)血管沿椎間盤裂隙的肉芽組織長入纖維環(huán)和髓核，這種神經(jīng)纖維的長入以及神經(jīng)分布密度的增加可能是椎間盤源性疼痛的解剖基礎(chǔ)。

與感受疼痛相關(guān)的神經(jīng)元分為NGF依賴性神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line－derived neurotrophic factor，GDNF)依賴性神經(jīng)元。NGF依賴性神經(jīng)元表達(dá)P物質(zhì)(substance P，SP)及降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene－related peptide，CGRP)，與炎癥疼痛相關(guān);GDNF依賴性神經(jīng)元表達(dá)結(jié)合凝集素B4，與各種疼痛如神經(jīng)損害相關(guān)的神經(jīng)性疼痛有關(guān)。在人類椎間盤中感覺神經(jīng)元是表達(dá)CGRP神經(jīng)元纖維，未發(fā)現(xiàn)結(jié)合凝集素B4神經(jīng)元纖維，椎間盤感覺神經(jīng)纖維主要是與炎癥疼痛相關(guān)的包含神經(jīng)肽的 NGF依賴性小神經(jīng)元[9，10]。NGF在疼痛椎間盤中的表達(dá)較在無癥狀的椎間盤中明顯增加，且存在表達(dá)NGF受體TrkA的神經(jīng)纖維和微小血管[1，2]。NGF 能支持神經(jīng)元存活，促進(jìn)其生長、分化，維持其功能[11]，對NGF起反應(yīng)的神經(jīng)元主要有交感神經(jīng)元、感覺神經(jīng)元和中樞膽堿能神經(jīng)元，NGF由這些神經(jīng)元的靶組織產(chǎn)生，被神經(jīng)元的軸突末梢攝取，籍逆運行運輸?shù)桨w，為這些神經(jīng)元的存活和維持所必需，所以，NGF是典型的靶源性神經(jīng)營養(yǎng)因子。體外培養(yǎng)實驗證實背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突生長依賴于髓核細(xì)胞分泌的NGF[12]，提示髓核細(xì)胞產(chǎn)生的NGF可能是神經(jīng)長入退變的椎間盤啟動因素。

NGF具有營養(yǎng)神經(jīng)和致敏傷害感受器的作用，在炎癥組織中NGF的合成明顯增加[13]。致炎因子IL－1β和TNF－α已被確定與椎間盤退變有明確關(guān)系[5]，且可誘發(fā)椎間盤細(xì)胞分泌 NGF[6，7]，從而誘導(dǎo)神經(jīng)纖維的長入和致敏椎間盤感覺神經(jīng)末梢而導(dǎo)致盤源性腰痛的發(fā)生。然而，Burke等[8]研究顯示椎間盤源性腰痛患者的椎間盤中促炎因子IL－6、IL－8、PGE的表達(dá)比不伴腰痛的坐骨神經(jīng)痛腰椎間盤突出患者明顯增高，卻未檢測到IL－1β和TNF－α的表達(dá)。進(jìn)一步的研究顯示，IL－6、IL－8在退變的椎間盤中表達(dá)明顯升高，而IL－1β和TNF－α則在椎間盤突出周圍的肉芽組織中高表達(dá)[14]。因此，我們推測IL－6、IL－8等因子在導(dǎo)致椎間盤源性腰痛的發(fā)生發(fā)展過程中可能起到了重要作用，但其是否通過提高椎間盤細(xì)胞分泌NGF進(jìn)而誘發(fā)了一系列反應(yīng)這一具體機制，有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)IL－1β、IL－6均可增強體外培養(yǎng)的人髓核細(xì)胞產(chǎn)生NGF的能力，同等濃度下IL－6具有更強的上調(diào)作用。但I(xiàn)L－1β、IL－6在正常和退變?nèi)俗甸g盤中的表達(dá)量尚需進(jìn)一步確定以明確其在何種濃度下何者發(fā)揮了更重要的作用。結(jié)合以往文獻(xiàn)，這一結(jié)果說明IL－6等因子可能通過提高椎間盤細(xì)胞分泌NGF，從而誘導(dǎo)神經(jīng)纖維長入椎間盤而導(dǎo)致盤源性腰痛的發(fā)生。

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