宮長榮，程 龍，宋朝鵬，王松鋒

（1.河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院，鄭州 450002；2.中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，青島 266101）

煙草在生長過程中，有大量的次生代謝產(chǎn)物從根系和葉片排出或滲出體外，這些代謝產(chǎn)物為各種微生物的生長提供了充足的營養(yǎng)，在成熟采收的煙葉表面和體內(nèi)形成特殊的微環(huán)境并存在著大量的微生物。微生物在縮短發(fā)酵時間、調(diào)控煙葉有害成分（如煙堿、蛋白質(zhì)、TSNA等）、增進煙葉香氣等方面對煙葉品質(zhì)改善中發(fā)揮著重要作用[1]。煙葉調(diào)制加工所需時間較短，此期間微生物的活動及其對煙葉品質(zhì)的影響也較少受到關注，對它們的研究報道較少。國外有研究表明，某些微生物在烘烤過程中對煙葉的腐爛和煙葉有害成分含量的消長等方面有重要影響[2-4]。

不同部位煙葉在不同烘烤時期的優(yōu)勢菌屬為最適宜當時營養(yǎng)條件的菌類，生命活動能力比同期的其他菌屬高。它們的自養(yǎng)異養(yǎng)所產(chǎn)生的生理生化作用對煙葉品質(zhì)造成一定影響。本試驗通過研究河南汝陽上、中、下三部位煙葉在烘烤過程中微生物的數(shù)量及優(yōu)勢種類的變化，探討煙葉烘烤過程優(yōu)勢微生物資源的可用性，為篩選和開發(fā)有利于烘烤過程提高煙葉品質(zhì)的微生物種群提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2008年7—10月進行，試驗材料取自于河南汝陽縣。供試烤煙品種為新 NC89，5月 5日移栽，種植行距120 cm，株距50 cm，田間管理按優(yōu)質(zhì)烤煙栽培生產(chǎn)技術規(guī)范進行。

1.2 試驗設計及樣品制備

取生長發(fā)育正常、成熟采收煙葉。采用河南農(nóng)業(yè)大學設計的電熱式溫濕自控密集烤煙箱進行常規(guī)烘烤。分別于開始烘烤以前及開始后取4次樣。即：鮮煙樣（成熟采收后烘烤前）；38℃（干球溫度38℃結(jié)束時，葉片八成黃）；42℃（干球溫度42℃結(jié)束時，葉片全黃）；48℃（干球溫度 48℃結(jié)束時，葉片葉筋全黃）。

1.3 微生物的分離及培養(yǎng)

每次隨即剪取煙樣 100 g，使用高壓滅菌后的研缽研碎，加無菌水定容到100 mL三角瓶，按常規(guī)稀釋平板涂抹法進行微生物的分離和計數(shù)，稀釋倍數(shù)選取 10-2，10-3，10-4，10-5。分離真菌用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、H2O 1 000 mL），使用前加入10%的卡那霉素溶液1 mL/L；分離細菌選取牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、H2O 1 000 mL、pH 7.0）。每次3個重復。取每次煙樣微生物分離中的最優(yōu)勢菌進行鑒定。

1.4 微生物的鑒定

真菌主要依據(jù)真菌鑒定手冊、真菌學及植物病原真菌學檢索表，進行鑒定。常見的典型真菌，依據(jù)菌絲分枝和孢子形態(tài)直接鑒定到屬，對于不產(chǎn)孢子的真菌，誘導其產(chǎn)生孢子后鑒定。參閱相關文獻[5-6]鑒定到屬。細菌采用KOH法，革蘭氏染色法，常規(guī)菌體形態(tài)觀察[7-8]后，使用法國梅里埃公司的VIEK32全自動細菌鑒定系統(tǒng)，選用快速陽性鑒定卡GNI+（V1316）和快速陰性鑒定卡GPI（V1315）鑒定到屬。

2 結(jié) 果

2.1 烘烤過程真菌的變化

從表1可以看出，鮮煙樣中，煙葉所含真菌數(shù)最少的是下部葉，為 0.65×105cfu/g，上部葉真菌量最多，為 0.79×105cfu/g。烘烤開始后，不同部位煙葉真菌含量均呈先下降后上升變化。這可能是由于烘烤從開始至干球38℃煙葉達到八成黃期間，烤箱內(nèi)的溫度低、濕度高，比較適宜細菌生長，煙葉含真菌量緩慢下降。干球38℃后，隨著烤房溫度上升濕度下降，不同部位煙葉的真菌量均緩慢上升，在干球42℃煙葉達到葉片全黃時達到最高。此時，中部葉真菌量最高，為1.12×105cfu/g，下部葉次之，為 1.07×105cfu/g。隨后，烤房溫度繼續(xù)上升濕度繼續(xù)下降，不同部位煙葉真菌含量呈下降趨勢。

表1 烘烤過程不同部位煙葉微生物的含量Table1 Amount of microorganism on flue-cured tobacco leaves during curing process

2.2 烘烤過程細菌的變化

不同部位煙葉在烘烤過程中各時期細菌總量變化情況見表1。結(jié)果顯示，不同部位的鮮煙葉，下部葉細菌量最多，為2.3×105cfu/g；上部葉細菌量最少為1.01×105cfu/g，這可能是由于上部葉受到陽光直射，下部葉接近地面且濕度較高更適宜細菌繁殖。烘烤過程開始時不同部位煙葉的細菌量均逐漸增多，到干球溫度38℃時不同部位煙葉細菌量均達到最大，中部葉含細菌量由鮮煙葉的1.63×105cfu/g升至 3.91×105cfu/g，高于此時期下部葉的2.83×105cfu/g和上部葉的2.98×105cfu/g。干球溫度38℃至42℃間不同部位煙葉細菌含量略微下降，其后隨煙葉的大量脫水干燥，細菌數(shù)量明顯下降。到48℃葉片葉筋全黃時期，煙葉細菌量已低于鮮煙葉時細菌量的1～2倍。

2.3 烘烤過程微生物優(yōu)勢菌屬的變化

不同部位不同烘烤時期優(yōu)勢菌屬鑒定結(jié)果見表2。共分離出不同的真菌優(yōu)勢屬5種，經(jīng)鑒定分別屬于枝孢霉屬(Cladosporium)、青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)、鏈格孢屬(Alternaria)、鐮刀菌屬(Fusarium)。其中各時期煙樣優(yōu)勢真菌中出現(xiàn)次數(shù)最多的優(yōu)勢類群為青霉菌和曲霉菌，其次為枝孢霉菌和鏈格孢菌。共分離鑒定出不同的細菌優(yōu)勢屬11種，分別為檸檬酸桿菌屬 (Citrobacter)，曼氏桿菌屬（Mannheimia)，棒桿菌屬(Corynebacterium)，芽孢桿菌屬(Bacillus)，腸桿菌屬(Enterobacter)，節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)，不動桿菌屬(Acinetobacter），巴斯德氏菌屬 (Pasteurella)，泛菌屬(Pantoea)，鞘氨醇單胞菌屬 (Sphingomonas)，假單胞菌屬(Pseudomonas)。

表2 煙葉烘烤過程中微生物優(yōu)勢菌群的變化Table2 Changes of dominant microorganism during the flue-curing process of tobacco leaves

3 討 論

下、中、上三個部位的烤煙煙葉在烘烤過程中，煙葉細菌最高含量出現(xiàn)在中部葉 38℃八成黃時期的2.98×105cfu/g。這比張樹堂等人研究的最高細菌含量少，原因可能是烤煙烘烤設備、細菌分離培養(yǎng)方法的不同。烘烤過程細菌含量變化規(guī)律與Morin研究基本一致[9-10]。鮮煙葉中出現(xiàn)的優(yōu)勢細菌，如檸檬酸桿菌屬、曼氏桿菌屬，是腸道中通常的棲居菌，常見于水、食物、糞便中，可以推斷鮮煙葉葉圍微生物的優(yōu)勢菌種類與煙葉生長部位、當?shù)厣a(chǎn)環(huán)境及管理有一定關系。3個不同部位煙葉烘烤過程中葉圍優(yōu)勢微生物的種類不完全相同，這可能與烤前不同部位鮮煙葉帶菌種類不相同有關。烘烤過程分離的優(yōu)勢細菌證明，棒桿菌屬、腸桿菌屬、芽孢桿菌屬、泛菌屬在干球48℃前適宜烤房內(nèi)環(huán)境并能較好的進行自養(yǎng)或異養(yǎng)活動。它們的自養(yǎng)異樣所產(chǎn)生的生理生化作用可能對煙葉品質(zhì)的影響強于其他菌屬。

煙草調(diào)制是煙葉采收后的一個重要加工環(huán)節(jié)，其可控性非常強，對利用微生物改進提高煙葉品質(zhì)非常有利。微生物資源豐富，代謝功能復雜，而且易于培養(yǎng)再生，因此，篩選開發(fā)利用對煙草品質(zhì)有利的微生物具有非常大的前景。本試驗分離到的微生物，僅僅是煙葉葉片組織中能在供試培養(yǎng)基上生長的菌株，要明確烘烤過程煙葉葉片組織所有微生物的種類，還有待于進一步的工作并嘗試其它分離、培養(yǎng)和鑒定方法。如采用更多種類的培養(yǎng)基、厭氧條件培養(yǎng)或分子生物學鑒定方法等。已鑒定的各種微生物對在烘烤過程中煙葉品質(zhì)的影響作用也有待于進一步研究。

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