李永濤 ，費(fèi)洪新 ，沈 雷 ，姜 楊 ，郭志鴻 ，高 磊 ，石小芳 ，劉文華

（1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161000；2.中國(guó)科學(xué)院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所，甘肅蘭州 730070）

白藜蘆醇（resveratrol，Res）是廣泛存在于葡萄、花生和多種傳統(tǒng)中藥中的一種多酚類化合物，具有降血脂、抗感染、抗氧化、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和促進(jìn)凋亡等生物學(xué)功能，是近年中西醫(yī)結(jié)合領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)[1-3]。本實(shí)驗(yàn)選用18月齡的衰老雌性昆明小鼠，觀察白藜蘆醇對(duì)肝細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)以及血清中SOD活力和MDA含量的影響，探討延緩肝細(xì)胞衰老的途徑和作用機(jī)制，為臨床肝硬化、肝癌的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用18月齡的自然衰老雌性昆明小鼠為實(shí)驗(yàn)組，體重（40±2） g；4 月齡青年雌性昆明小鼠為青年對(duì)照組，體重（18±1） g，均由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心黃小義博士提供。將昆明小鼠做陰道細(xì)胞涂片，連續(xù)檢查2個(gè)動(dòng)情周期，無(wú)規(guī)律性周期變化者確定為自然衰老昆明小鼠，隨機(jī)分為四組，分別為衰老對(duì)照組和白藜蘆醇小、中、大劑量（40、120、180 mg/ml）組，連續(xù)腹腔注射9周，青年對(duì)照組注射等量生理鹽水。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

白藜蘆醇（Sigma公司）用二甲基亞砜（DMSO）配制；RPMI-1640（Gibco/BRL 公司，USA）；Bcl-2 兔抗鼠多克隆抗體、Bax兔抗鼠多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；SABC（兔IgG）-POD試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；MTT（上海華舜生物工程有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采集與制備

雌性昆明小鼠末次給藥24 h后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物眶內(nèi)靜脈取血，取血后昆明小鼠斷頭處死，迅速摘取肝細(xì)胞，一側(cè)置于10%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋切片。

1.4 血清總SOD活力和MDA含量的測(cè)定

冰臺(tái)上迅速取肝臟，放于Carnoy溶液固定后，制作石蠟切片，用 PBS 液（0.01 mol/L，pH 7.4）沖洗 3 次，每次 5 min。H2O2室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，室溫下孵育10 min，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min。10%正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10 min。傾去上清液，勿洗，滴加1∶100比例稀釋的一抗，37℃孵育1h。PBS沖洗，5min×3次。滴加第二代生物素標(biāo)記過(guò)的二抗工作液，37℃或室溫孵育30 min。PBS沖洗，5 min×3次。滴加第二代辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育 30 min。PBS沖洗，5 min×3次。顯色劑（DAB）顯色，使用DAB顯色試劑盒，取1 ml蒸餾水，加A、B、C試劑各1滴，混勻后加至切片上，室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間。自來(lái)水充分沖洗，蘇木精復(fù)染，封片。治療組除用PBS代替一抗外，其他步驟相同。昆明小鼠處死后馬上剝離肝臟，加入組織裂解液（50 mmol/L，Tris-HCl緩沖液，pH 7.4，10 g/L PMSF，0.5 mol/L EDTA），制成勻漿，4℃離心 30 min，用 2.5%戊二醛固定，繼續(xù)用2%四氧化鋨固定，脫水、包埋、切片和染色按常規(guī)處理，觀察拍照，檢測(cè)SOD、MDA的活性。

1.5 肝組織中Bcl-2及Bax的測(cè)定

用免疫組織化學(xué)SABC法，Bcl-2定位于核膜、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體膜上，Bax定位于胞質(zhì)。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果判定采用組織化學(xué)評(píng)分法。陽(yáng)性染色為胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，以i代表染色深淺，根據(jù)細(xì)胞著色的強(qiáng)弱分為4個(gè)等級(jí)：無(wú)著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。該評(píng)分法可反映單個(gè)細(xì)胞是否具有陽(yáng)性表達(dá)及表達(dá)強(qiáng)弱，更客觀地評(píng)價(jià)細(xì)胞蛋白的表達(dá)情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 昆明小鼠血清SOD活力和MDA含量的變化

40、120、180 mg/ml各組白藜蘆醇與衰老對(duì)照組比較，SOD水平有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，衰老對(duì)照組昆明小鼠SOD水平低于青年對(duì)照組（P<0.05）。衰老對(duì)照組MDA含量顯著高于青年對(duì)照組，各白藜蘆醇劑量組MDA含量均顯著低于衰老對(duì)照組（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 昆明小鼠血清SOD活力和MDA含量的變化（）

表1 昆明小鼠血清SOD活力和MDA含量的變化（）

與衰老對(duì)照組比較，*P<0.05

組別 SOD（U/ml） MDA（nmol/ml）青年對(duì)照組156.12±2.136.34±0.09衰老對(duì)照組105.54±4.259.46±0.10白藜蘆醇小劑量組111.27±1.245.29±0.25白藜蘆醇中劑量組125.45±3.28*4.58±0.34*白藜蘆醇大劑量組159.34±5.262.49±0.04

2.2 昆明小鼠肝細(xì)胞Bcl-2及Bax的表達(dá)情況（圖1、2）

青年對(duì)照組中昆明小鼠肝組織肝細(xì)胞形態(tài)清晰，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核大而圓，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛（圖1A）；衰老對(duì)照組中可以見(jiàn)到肝組織中肝細(xì)胞界限不清，細(xì)胞核深染，胞質(zhì)中可以見(jiàn)到染色深的棕黃色結(jié)構(gòu)（圖1B）；白藜蘆醇中劑量組可見(jiàn)肝組織Bcl-2表達(dá)量少的組織中棕黃色顆粒較少，Bax表達(dá)肝組織中棕黃色顆粒較多（圖1D、圖2D）；提示衰老對(duì)照組Bcl-2表達(dá)降低，Bax表達(dá)升高，胞質(zhì)中棕黃色的顆粒較多（圖2B），Bcl-2/Bax比值明顯減小，白藜蘆醇劑量組Bcl-2表達(dá)有升高趨勢(shì)，而B(niǎo)ax表達(dá)低于衰老對(duì)照組（P<0.05），各白藜蘆醇劑量組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，白藜蘆醇劑量組Bcl-2/Bax比值高于衰老對(duì)照組（P<0.05），提示120 mg/ml白藜蘆醇可調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)和對(duì)抗自由基對(duì)肝細(xì)胞的損傷。

圖1 昆明小鼠肝細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)情況

圖2 昆明小鼠肝細(xì)胞Bax的表達(dá)情況

2.3 昆明小鼠肝細(xì)胞Bcl-2及Bax的表達(dá)水平 見(jiàn)表2。

表2 昆明小鼠肝細(xì)胞Bcl-2及Bax的表達(dá)情況（）

表2 昆明小鼠肝細(xì)胞Bcl-2及Bax的表達(dá)情況（）

與衰老對(duì)照組比較，*P<0.05

組別 Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax青年對(duì)照組3.145±0.203*2.458±0.109*1.280±0.014*衰老對(duì)照組1.576±0.0245.147±0.0380.306±0.008白藜蘆醇小劑量組1.943±0.0033.167±0.4150.613±0.011白藜蘆醇中劑量組2.134±0.1502.984±0.2700.715±0.102白藜蘆醇大劑量組2.963±0.0082.457±0.0201.206±0.072

從表2中可以看出，昆明小鼠衰老后Bcl-2/Bax比值減小，昆明小鼠處于青壯年后Bcl-2/Bax比值增大，提示肝細(xì)胞的老化與Bcl-2/Bax密切相關(guān)。白藜蘆醇中劑量組（120 mg/ml）作用于衰老昆明小鼠后Bcl-2/Bax升高明顯，提示白藜蘆醇作用于昆明小鼠肝組織后，可以改善Bcl-2/Bax，對(duì)衰老小鼠有一定的治療作用。

3 討論

白藜蘆醇分子式為C14H12O3，分子量為228.25 D，是許多植物中存在的一種活性非黃酮類多酚化合物，呈白色針狀晶體，難溶于水，能溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮、DMSO等極性強(qiáng)的溶劑中。單藥應(yīng)用對(duì)晚期乳腺癌、肺癌、頭頸部癌、食管癌、淋巴瘤均有一定的療效，被認(rèn)為是一種廣譜抗癌藥物，聯(lián)合其他常用抗腫瘤藥物，療效明顯提高，成為最有效的抗腫瘤藥之一。自1940年該成分被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，一直受到醫(yī)藥界的重視。研究表明，白藜蘆醇具有抗腫瘤、抗心血管疾病、抗氧化、抗菌、抗感染、抑制血小板聚集、調(diào)節(jié)免疫等作用，已成為科學(xué)家們高度重視的天然活性成分，具有很大的藥用價(jià)值和市場(chǎng)前景[4-6]。

細(xì)胞是否發(fā)生凋亡與凋亡抑制因子和凋亡活化因子之間的平衡密切相關(guān)。其中重要的有凋亡抑制因子Bcl-2、Bcl-XL和凋亡活化因子Bax、Bad等。bcl-2基因及其表達(dá)蛋白可明顯延長(zhǎng)細(xì)胞的存活時(shí)間，bcl-2基因位于18q21上，約230 kb，該基因有3個(gè)外顯子和2個(gè)啟動(dòng)子，指導(dǎo)Bcl-2蛋白的合成。Bcl-2蛋白是一個(gè)線粒體外膜蛋白，其C端由19個(gè)氨基酸組成疏水段，使Bcl-2蛋白可以鉚釘于核膜、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體膜上，可能在核的運(yùn)輸、核微孔復(fù)合物的形成和核膜的維持等方面起重要作用。bax與bcl-2基因具有40%的同源性，位于19號(hào)染色體，長(zhǎng)約4.5 kb，有6個(gè)外顯子，指導(dǎo)Bax蛋白的合成。Bax增高，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Bcl-2增高，抑制細(xì)胞凋亡，Bcl-2與Bax的相互作用是其中心環(huán)節(jié)[7-8]。白藜蘆醇作用于衰老昆明小鼠后Bcl-2/Bax升高明顯，提示白藜蘆醇作用于昆明小鼠肝組織后，可以改善Bcl-2/Bax，對(duì)衰老小鼠有一定的治療作用。

SOD是體內(nèi)最重要的抗氧化酶，可明顯增加O2-的歧化反應(yīng)速度，從而清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的氧自由基，以減少氧自由基對(duì)細(xì)胞的損傷。如果SOD活性不足，不能及時(shí)發(fā)揮抗氧化作用，細(xì)胞就會(huì)受到氧自由基的攻擊，引起細(xì)胞損傷。自由基對(duì)生殖功能有很大的影響，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抗氧化酶活性下降，氧自由基含量增多，會(huì)導(dǎo)致黃體細(xì)胞凋亡，引起黃體萎縮和凋亡，引起卵泡閉鎖[9-10]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化物的代謝產(chǎn)物，如果細(xì)胞內(nèi)氧自由基增多，可以與細(xì)胞質(zhì)膜上磷脂中的多價(jià)不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生過(guò)氧化物，過(guò)氧化物進(jìn)一步裂解成具有細(xì)胞毒性的MDA。MDA有很強(qiáng)的生物活性，而且化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定，在很低的濃度下即可明顯抑制細(xì)胞內(nèi)許多酶的功能，通常用MDA來(lái)反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，間接反映氧自由基對(duì)細(xì)胞的損傷程度[11-12]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，衰老對(duì)照組血清SOD活力下降，MDA含量升高，表明衰老昆明小鼠有明顯的自由基損傷，給予白藜蘆醇后SOD活力雖有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；MDA含量明顯下降，提示白藜蘆醇可能通過(guò)抑制自由基的產(chǎn)生或直接清除自由基等途徑減少自由基對(duì)細(xì)胞的損傷。

綜上所述，白藜蘆醇可以通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)以及對(duì)抗自由基對(duì)細(xì)胞的損傷來(lái)抑制細(xì)胞凋亡，而對(duì)細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用。白藜蘆醇對(duì)Bcl-2、Bax蛋白的調(diào)控可能是由于白藜蘆醇通過(guò)對(duì)抗自由基作用降低細(xì)胞內(nèi)有毒性的MDA等脂質(zhì)過(guò)氧化物的含量，恢復(fù)了細(xì)胞內(nèi)相關(guān)酶的活性，進(jìn)而調(diào)控Bcl-2/Bax蛋白的表達(dá)，其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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