米簡(jiǎn)潔 朱慶鴻 付紅燁 劉 越 趙 佳 康友敏

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100193)

免疫抑制劑是對(duì)機(jī)體的免疫反應(yīng)具有抑制作用的藥物,臨床上主要應(yīng)用于自身免疫性疾病患者的治療,但這些免疫抑制劑在臨床應(yīng)用中存在不同程度的毒副作用。新近的研究表明有些免疫抑制劑能夠在體外刺激天然T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有抑制功能的Treg細(xì)胞[1,2]。

自身免疫性疾病(Autoimmune Disease,AD)是機(jī)體對(duì)自身抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng),達(dá)到一定強(qiáng)度以致能破壞自身正常組織結(jié)構(gòu),并引起一定的臨床癥狀,如多發(fā)性硬化癥(Multiple Sclerosis,MS)、Ⅰ型糖尿病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等。研究表明調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量減少或功能異常均可能導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生[3-5]。由于迄今對(duì)該類疾病的病因認(rèn)識(shí)不清,對(duì)其發(fā)病機(jī)制研究不透,目前對(duì)于自身免疫性疾病的預(yù)防和治療還沒有理想的方法和藥物。疫苗免疫包括DNA疫苗,已經(jīng)被證實(shí)能夠產(chǎn)生長(zhǎng)期有效的免疫反應(yīng),重要的是疫苗免疫能夠產(chǎn)生抗原特異性,并能夠形成免疫記憶[6-8]。因此,本研究將免疫抑制劑作為自身免疫性疾病自身抗原的DNA疫苗佐劑共同免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性的Treg細(xì)胞,并對(duì)其預(yù)防AD進(jìn)行初步的研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫 雌性C57BL/6小鼠(購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所),6～8周齡,每組8只。MS的DNA疫苗(p2MOG35)為實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。每只小鼠肌肉注射 p2MOG35100μg,FK506(Astellas Ireland Co.,Ltd)、CsA(Novartis Pharma GmbH,Germany)或MMF(Roche Registration Ltd.U.K.)10 μg,免疫兩次,間隔 2周 。

1.2 細(xì)胞內(nèi)染色 在第二次免疫后7天,取小鼠脾臟,制備成單細(xì)胞懸液,裂解紅細(xì)胞后,利用細(xì)胞胞內(nèi)染色的方法,1×106細(xì)胞加入PMA 50μg/ml和離子霉素100 ng/ml,同時(shí)加入莫能霉素(Golgisop產(chǎn)品),于37℃、5%CO2孵箱培育 4小時(shí),利用 4%的多聚甲醛固定,0.1%的皂素破膜后,加入熒光標(biāo)記的抗小鼠CD4、CD25、Foxp3的單克隆抗體(購(gòu)于ebioscience)進(jìn)行染色,流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),CD4+CD25+Foxp3+的T細(xì)胞為 Treg細(xì)胞,CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞占總CD4+T的比例即Treg細(xì)胞比例。同時(shí)取樣品利用抗小鼠CD11c和IL-10熒光標(biāo)記單克隆抗體(購(gòu)于ebioscience)進(jìn)行染色,CD11c+IL-10+細(xì)胞即表達(dá)IL-10的DCs細(xì)胞,結(jié)果以CD11c+IL-10+細(xì)胞占CD11c+細(xì)胞的比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 T細(xì)胞增殖 在第二次免疫后7天,取各組小鼠脾臟,制備成單細(xì)胞懸液,裂解紅細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),利用R&D系統(tǒng)分離純化CD4+T細(xì)胞加入96孔平底細(xì)胞板(Costar產(chǎn)品),每孔加入1×105～2×105個(gè)細(xì)胞,利用德國(guó)美天旎CD11c純化試劑盒分離純化naive小鼠的CD11c+細(xì)胞作為抗原遞呈細(xì)胞(APC),每孔加入1×104～2×104個(gè)細(xì)胞,分別加入MOG35～55多肽作為抗原刺激(終濃度5μg/ml),同時(shí)加入ConA(陽性對(duì)照,終濃度5μg/ml),BSA(非特異性抗原,終濃度5μg/ml)作為陽性和無關(guān)抗原對(duì)照,刺激 72小時(shí)后,每孔加入20μl MTT溶液顯色,37℃,5%CO2,培養(yǎng)3～4小時(shí)后,用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm的OD值進(jìn)行讀數(shù),結(jié)果以刺激指數(shù)(SI)計(jì)算,公式為:SI=(各刺激孔OD值-培養(yǎng)基OD值)/(未刺激孔OD值-培養(yǎng)基OD值)。

1.4 EAE實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型 將完全弗氏佐劑(CFA,Sigma)與MOG35～55多肽充分乳化后,皮下多點(diǎn)注射雌性C57BL/6小鼠,每只小鼠注射 100μl(200μg MOG35～55多肽與50 μl CFA),同時(shí)向腹腔注射百日咳毒素(每只小鼠200 ng,Sigma),24小時(shí)候后再次腹腔注射百日咳毒素,以誘導(dǎo)小鼠發(fā)病。對(duì)誘導(dǎo)后的小鼠每天進(jìn)行臨床打分,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下:0分,不發(fā)病;1分,尾部張力降低;2分,尾部無張力或后肢中度無力;3分,雙側(cè)后肢麻痹;4分,后肢麻痹伴前肢力弱或麻痹;5分,瀕臨死亡或死亡。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用t檢驗(yàn)進(jìn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P＜0.05差異顯著,P＜0.01差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同免疫抑制劑對(duì)Treg細(xì)胞比例的影響 利用CsA、FK506或MMF作為佐劑與p2MOG35共同免疫小鼠兩次,間隔2周。第二次免疫后7天,取脾臟單細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)抗體染色,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Treg細(xì)胞的比例,結(jié)果如圖 1所示,FK506與p2MOG35共同免疫組Treg細(xì)胞的比例最高為15%,顯著高于p2MOG35單獨(dú)免疫組(P＜0.05),CsA或MMF作為佐劑與p2MOG35共同免疫組與對(duì)照組相比,沒有顯著差異,表明FK506作為p2MOG35的佐劑能夠誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生,使Treg細(xì)胞的比例顯著升高。

2.2 不同免疫抑制劑對(duì)T細(xì)胞增殖的影響 利用CsA、FK506或MMF作為佐劑與p2MOG35共同免疫小鼠兩次,間隔2周。第二次免疫后7天,取脾臟單細(xì)胞進(jìn)行T細(xì)胞增殖試驗(yàn),結(jié)果如圖2所示。小鼠免疫FK506/p2MOG35組的SI與p2MOG35組相比顯著降低(P＜0.05)。CsA或MMF作為佐劑與p2MOG35共同免疫組的SI與對(duì)照組相比,沒有顯著差異,表明FK506作為p2MOG35的佐劑免疫小鼠后,能夠顯著抑制T細(xì)胞增殖反應(yīng)。因此在后續(xù)試驗(yàn)中,我們選用FK506作為p2MOG35抑制型的佐劑進(jìn)行多發(fā)性硬化癥的預(yù)防。

圖1 不同免疫抑制劑對(duì)Treg細(xì)胞的影響Fig.1 The immunosuppressants effect on Treg

圖2 不同免疫抑制劑對(duì)T細(xì)胞增殖的影響Fig.2 The immunosuppressants effect on T cell proliferation

圖3 FK506作為佐劑對(duì)DC成熟的影響Fig.3 FK506 effect as adjuvant on DC maturation

2.3 FK506對(duì)DCs細(xì)胞的影響 DCs細(xì)胞接受抗原刺激后的成熟狀態(tài),直接影響免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。第二次免疫后7天,取脾臟單細(xì)胞進(jìn)行表面分子抗體染色,檢測(cè)DCs細(xì)胞的成熟狀態(tài)。結(jié)果如圖3所示,FK506與 p2MOG35共同免疫組成熟 DCs細(xì)胞(CD11c+CD80+)的比例顯著低于p2MOG35免疫組,表明FK506作為佐劑能夠抑制DCs細(xì)胞的成熟。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCs細(xì)胞表達(dá)IL-10的變化,結(jié)果如圖4所示,FK506與p2MOG35共同免疫組DCs細(xì)胞表達(dá)IL-10的比例最高為9.8%,顯著高于其他對(duì)照組,表明FK506作為佐劑能夠增強(qiáng)DCs細(xì)胞表達(dá)IL-10的能力。

2.4 FK506作為佐劑預(yù)防EAE的效果 利用FK506作為佐劑與p2MOG35共同免疫小鼠兩次,間隔2周。第二次免疫后7天誘導(dǎo)小鼠EAE模型,進(jìn)行臨床打分,觀察小鼠EAE發(fā)病的變化。在發(fā)病高峰比較臨床打分結(jié)果如圖5所示。與p2MOG35免疫組相比,FK506與p2MOG35共同免疫組臨床打分顯著降低(P＜0.01),表明FK506作為佐劑能夠預(yù)防EAE的發(fā)病。

3 討論

圖4 FK506作為佐劑對(duì)DC細(xì)胞分泌IL-10的影響Fig.4 FK 506 effect as adjuvant on IL-10 expression in DC

圖5 FK506作為佐劑對(duì)EAE發(fā)病的影響Fig.5 FK506 effect as adjuvant on EAE

免疫抑制劑是能夠抑制機(jī)體免疫反應(yīng)的藥物,主要應(yīng)用于器官移植排斥反應(yīng)、自身免疫病及過敏應(yīng)的治療[9,10]。近年來研究發(fā)現(xiàn)有些免疫抑制劑反能夠影響Treg細(xì)胞的產(chǎn)生和功能[11,12]。DNA疫苗能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生具有抗原專一性的免疫反應(yīng),是預(yù)防和治療疾病的重要和有效途徑。疫苗免疫能夠產(chǎn)生免疫記憶細(xì)胞,再次遇到抗原將會(huì)在短時(shí)間內(nèi)大量地?cái)U(kuò)增特異性的免疫細(xì)胞,重要的是疫苗免疫能夠產(chǎn)生抗原特異性的。本研究探討了免疫耐受佐劑作為DNA疫苗佐劑對(duì)Treg細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的影響。不同免疫抑制劑對(duì)Treg細(xì)胞的影響不同[13-15],因此我們比較了FK506、CsA或MMF作為DNA疫苗佐劑,對(duì)誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的影響,結(jié)果表明FK506能夠誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生,而CsA或MMF卻不能。因此我們選用FK506作為DNA疫苗佐劑,并發(fā)現(xiàn)免疫后小鼠T細(xì)胞增殖反應(yīng)顯著受到了抑制。

DCs是目前已知體內(nèi)效力最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞(APC),具有向免疫細(xì)胞遞呈抗原、影響T細(xì)胞亞群分化和誘導(dǎo)免疫耐受等功能。DCs以成熟DCs和不成熟DCs兩種狀態(tài)存在。機(jī)體內(nèi)不成熟DCs可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性Treg細(xì)胞[16,17]。本研究證明FK506作為DNA疫苗佐劑能夠抑制小鼠DCs細(xì)胞的成熟,增加分泌抑制型細(xì)胞因子IL-10的產(chǎn)生,進(jìn)而上調(diào)Treg細(xì)胞的比例,并降低EAE的發(fā)病癥狀。

綜上所述,FK506作為DNA疫苗佐劑能夠顯著抑制小鼠DCs細(xì)胞的成熟,能夠分泌抑制型細(xì)胞因子IL-10,刺激Treg細(xì)胞的產(chǎn)生,并且能夠預(yù)防EAE的發(fā)病,為自身免疫疾病的研究提供了新的方法和思路。

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