王曉雯 ，彭 寧 ，張 鵬 ，左 燕 ，張亞軍 ，趙新鋒

(1.陜西省人民醫(yī)院藥劑科，陜西 西安 710068; 2.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710069)

紅花為菊科一年生草本植物紅花 Carthamus tinctorius L.的干燥花，具有活血通經(jīng)、散瘀止痛的功效[1]。藥理研究表明，黃酮類和色素類成分為紅花擴(kuò)張血管、增加冠脈流量和改善心腦血液循環(huán)的主要有效成分[2]。趙明波等[3]以羥基紅花黃色素A為基準(zhǔn)物，對(duì)不同產(chǎn)地的紅花藥材進(jìn)行了指紋圖譜分析。但除了基準(zhǔn)物，上述研究未能對(duì)色譜峰進(jìn)行歸屬，其原因在于缺少紅花藥材有效成分群的定性分析方法。筆者采用高效液相色譜-二極管陣列-離子阱質(zhì)譜(HPLC-DAD-MSn)法對(duì)紅花水提物中的黃酮類成分進(jìn)行了定性分析，旨在為紅花指紋圖譜研究中色譜峰的歸屬提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1100系列高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)，包括在線真空脫氣機(jī)、二元梯度泵、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器;SL型離子阱質(zhì)譜(美國(guó)安捷倫公司);Maxima超純水機(jī)(美國(guó)基因公司);Sartorius BP221S型萬(wàn)分之一電子天平(美國(guó)Sartorius公司)。紅花藥材(新疆產(chǎn)，經(jīng)陜西省食品藥品檢驗(yàn)所鑒定);槲皮素化學(xué)對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為100081-200406);羥基紅花黃色素A化學(xué)對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為11637-200503);色譜純乙腈(Fisher公司，美國(guó))，超純蒸餾水(自制)，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent SB-C18柱(150 mm ×2.1 mm，5 μm);流速:0.2 mL/min;柱溫:30℃;檢測(cè)波長(zhǎng):0～10.0 min為280 nm，10.0～25.0 min為 370 nm，25.0～45.0 min為 430 nm;流動(dòng)相:A為0.2%的甲酸水溶液，B為甲醇，梯度洗脫，0～20.0 min為30%B，20.0～30.0 min為 30%B→65%B，30.0～45.0 min為 65%B。在此條件下，紅花水提物的高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 紅花水提物高效液相色譜圖

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧負(fù)離子模式(ESI-)電離，霧化氣壓強(qiáng)為275 kPa，干燥氣流速為7.0 mL/min，干燥氣溫度為325℃，毛細(xì)管電壓為-4200 V，掃描范圍為50～1500 amu。在此條件下，紅花水提物的ESI-MS總離子流圖見(jiàn)圖2。

圖2 紅花水提物總離子流圖

2.3 溶液制備

分別精密稱取槲皮素和羥基紅花黃色素A對(duì)照品0.012 g和0.016 g，以30.0%的甲醇水溶液溶解，分別置2個(gè)25.0 mL具塞量瓶中，加甲醇至刻度，制備成質(zhì)量濃度分別為0.48 g/L和0.64 g/L的對(duì)照品溶液，4℃冷藏備用。取干燥至恒重的紅花藥材10.0 g，置250 mL圓底燒瓶中，加10倍量水，加熱回流1.5 h，重復(fù)3次，抽濾，合并濾液，減壓濃縮至膏狀物，真空干燥，研磨成粉，以30.0%的甲醇水溶液定容于500.0 mL具塞量瓶中，即紅花藥材供試品溶液。4℃冷藏備用。

2.4 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:分別精密吸取2.3項(xiàng)下槲皮素和羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液適量，用30.0%的甲醇水溶液稀釋為系列對(duì)照品溶液。在擬訂的分析條件下，分別進(jìn)樣10.0 μL，對(duì)離子阱質(zhì)譜的多級(jí)反應(yīng)模式(MRM)進(jìn)行分析。槲皮素選擇 m/z 301.1→m/z 283.0為離子對(duì)，羥基紅花黃色素A選擇 m/z 611.2→m/z 449.1為離子對(duì)，測(cè)定提取離子流圖的峰面積。分別以槲皮素和羥基紅花黃色素A提取離子流圖的峰面積對(duì)其質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程分別為 Y=12.4 X+1.2(r=0.9998)和 Y=5.1 X+0.4(r=0.9997)，質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.48～48.0 μg/mL和0.64～320 μg/mL。

精密度試驗(yàn):按2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，用30%甲醇水溶液稀釋10倍后，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次10.0 μL，在擬訂的分析條件下，分別測(cè)定槲皮素和羥基紅花黃色素A的提取離子流圖的峰面積，計(jì)算得其標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD分別為1.2%和0.87%。

穩(wěn)定性試驗(yàn):按2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，以30%甲醇水溶液稀釋10倍后，每2 h進(jìn)樣1次，每次10.0 μL，在擬訂的分析條件下測(cè)定峰面積。結(jié)果48 h內(nèi)槲皮素和羥基紅花黃色素A峰面積的 RSD分別為1.3%和1.0%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

重復(fù)性試驗(yàn):按2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備5份供試品溶液，以30%甲醇水溶液稀釋10倍后，分別進(jìn)樣，每份每次10.0 μL，在擬訂的分析條件下測(cè)定峰面積。結(jié)果槲皮素和羥基紅花黃色素A峰面積的 RSD分別為1.1%和1.2%。

回收率試驗(yàn):取適量已知槲皮素和羥基紅花黃色素A含量的紅花藥材5份，精密加入2.3項(xiàng)下槲皮素和羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液適量后，按2.3項(xiàng)下方法制備成供試品溶液。以30%甲醇水溶液稀釋10倍后，在擬訂的分析條件下分別進(jìn)樣10.0 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果槲皮素和羥基紅花黃色素A的平均回收率分別為98.7%和99.2%。

2.5 樣品含量測(cè)定

按2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備紅花供試品溶液5份，以30%甲醇水溶液稀釋10倍后，在擬訂的分析條件下進(jìn)樣，外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果紅花藥材中槲皮素和羥基紅花黃色素A的平均含量分別為0.13%和1.14%。

2.6 有效成分群定性分析

取2.3項(xiàng)下制備的供試品溶液，以30%甲醇水溶液稀釋10倍后，在擬訂的分析條件下進(jìn)樣10.0 μL。通過(guò)二極管陣列全掃描技術(shù)，按擬訂的色譜條件設(shè)定單通道多波長(zhǎng)，獲得藥材供試品溶液的紫外色譜圖。比較紫外色譜圖和全掃描總離子流圖，二者基本對(duì)應(yīng)。然而，紫外色譜圖中有個(gè)別吸收很大的峰，在相應(yīng)的總離子流圖中強(qiáng)度卻較弱，提示這些化合物在擬訂的質(zhì)譜條件下很難被離子化;此外，總離子流圖上有許多強(qiáng)度較大的峰，在相應(yīng)的紫外色譜圖上卻沒(méi)有明顯的吸收，推測(cè)紅花藥材中含有大量的紫外吸收弱、易離子化的化合物。在獲得藥材供試品溶液全掃描總離子流圖的基礎(chǔ)上，利用離子阱質(zhì)譜的步進(jìn)式碰撞技術(shù)，通過(guò)改變電場(chǎng)梯度和能量梯度，獲得總離子流圖中各峰的多級(jí)碎片信息，通過(guò)對(duì)照并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[4-5]對(duì)各峰進(jìn)行歸屬(見(jiàn)表1)，定性分析了19種化學(xué)成分，其中1種為未知化學(xué)成分。

表1 紅花水提物電噴霧質(zhì)譜解析表

3 討論

總結(jié)紅花中查耳酮類化合物在負(fù)離子模式下的裂解特征，發(fā)現(xiàn)該類化合物的結(jié)構(gòu)中糖與苷元以C—苷鍵形式連接，通常情況下C—苷鍵較難發(fā)生斷裂。因此，在負(fù)離子模式下，[M-H]-離子主要發(fā)生3'位或4'位取代基上的消除反應(yīng)，以延長(zhǎng)苷元結(jié)構(gòu)中的共軛體系，如常可見(jiàn)丟失中性片斷(相對(duì)分子質(zhì)量為120)后所得基峰碎片離子。而對(duì)于多數(shù)糖苷類(包括黃酮苷類)化合物，在負(fù)離子模式下，主要發(fā)生糖苷鍵斷裂，產(chǎn)生丟失糖片斷后所得的碎片離子。該特性可用于區(qū)分醌型查耳酮類化合物與黃酮類化合物。

通過(guò)HPLC-ESI-MSn分析，對(duì)紅花水提物中19種化學(xué)成分進(jìn)行質(zhì)譜解析，在確定18種化學(xué)成分的基礎(chǔ)上，初步發(fā)現(xiàn)了1種未知的化學(xué)成分，對(duì)這種化學(xué)成分結(jié)構(gòu)的定性還需進(jìn)一步的研究。

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