黃金珠 方云蕓 傅春華 成都中醫(yī)藥大學(xué)科技處(成都 611137)

通脈大生片是成都中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院用于婦科臨床 50余年的重點(diǎn)院內(nèi)制劑。該方來(lái)源于著名中醫(yī)學(xué)家卓雨農(nóng)老先生自制方“通脈大生丸”,由紫河車、肉蓯蓉、杜仲等 17味中藥組成 ,具有溫腎填沖,調(diào)補(bǔ)氣血,通暢脈絡(luò)等作用,在腎虛、沖任虛損所致的排卵障礙、黃體功能不健的不孕癥等方面取得較好的臨床療效。本實(shí)驗(yàn)主要研究通脈大生片對(duì)排卵障礙型大鼠的的胰島素生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)及其受體(IGF-1R)的影響,以期證明用溫腎填沖,調(diào)補(bǔ)氣血,通暢脈絡(luò)的中醫(yī)方藥對(duì)腎虛、沖任虛損所致的排卵障礙、黃體功能不健的不孕癥有較好的臨床價(jià)值。

1 材料與方法 1.1 材料 1.1.1 動(dòng)物:健康 9日齡 SD系雌性大鼠,出生后母鼠哺乳至 22日齡斷奶,專人飼養(yǎng)。利用自然光照,室溫維持在 20～25℃ ,動(dòng)物和飼料均由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,SD大鼠批號(hào)為:SCXK(川)2008-11。

1.1.2 試劑及儀器:丙酸睪丸酮注射液(規(guī)格:1m L:25mg)天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn),國(guó)藥準(zhǔn)字 H12020531;通脈大生片(由杜仲、續(xù)斷、桑寄生、肉蓯蓉、紫河車、茯苓、山藥等組成),規(guī)格:0.3g/粒,成都中醫(yī)藥大學(xué)院內(nèi)制劑,川藥制字Z20070648;枸櫞酸氯米芬片 (規(guī)格:50mg/片)賽普路斯企業(yè)生產(chǎn),進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào):H20040352;大鼠胰島素生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)酶聯(lián)免疫分析試劑盒,批號(hào):DEZ30653,由 RD公司提供;胰島素生長(zhǎng)因子-1R(IGF-1R)一抗 bs-0680R,由博奧森公司提供,IGF-1R二抗 sp-9001兔抗,由中杉金橋公司提供,批號(hào):511783 A?？烧{(diào)式移液器:美國(guó) PALL-Gelman公司;全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀 MK 3:芬蘭雷勃。ILDZ4-018離心機(jī):北京醫(yī)用離心機(jī)廠。783643型光學(xué)顯微鏡為日本O LYMPUS公司生產(chǎn);BI2004圖像分析系統(tǒng)儀由成都泰盟科技有限公司提供。

1.2 方 法 1.2.1 模型復(fù)制及分組方法:應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包產(chǎn)生的隨機(jī)數(shù)字表,將 66只 9日齡 SD雌性大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組,模型組,通脈大生片高劑量組,通脈大生片中劑量組,通脈大生片低劑量組,克羅米芬對(duì)照組,共 6組。參照俞瑾等[1]研究方法,于實(shí)驗(yàn)組和模型組頸背部皮下注射丙酸睪丸酮 1.25mg/只 (0.05m L/只)。正常組在同等條件下飼養(yǎng),未作特殊處理,第 22日齡斷奶,利用自然光照,室溫維持在 20℃左右 ,并由專人在同樣條件飼養(yǎng)。第 70日齡(大鼠體重約 150g左右)陰道開(kāi)口。連續(xù)陰道涂片 2個(gè)性周期(1個(gè)性周期為 5d),觀察其陰道上皮細(xì)胞有無(wú)性周期變化,陰道上皮無(wú)性周期變化,則提示無(wú)排卵大鼠模型制作成功。

1.2.2 給藥方法:從第 80d開(kāi)始 ,各組分別按如下方法給藥,按臨床用藥,以 60 kg人為標(biāo)準(zhǔn),按照體重—?jiǎng)┝繐Q算法計(jì)算大鼠給藥劑量。模型組和正常組給 1m L(100g? d)生理鹽水灌胃;通脈大生片高劑量組給予 0.12g/m L(100g? d)灌胃;通脈大生片中劑量組給予 0.06g/m L(100g? d)灌胃;通脈大生片低劑量組給予 0.03g/m L(100g? d)灌胃;克羅米芬組給予0.83mg/m L(100g? d)灌胃,每天灌胃 1次,連續(xù)灌胃 5周后股動(dòng)脈取血處死大鼠。

1.2.3 檢測(cè)方法:陰道脫落細(xì)胞檢查:給藥 25d后,對(duì)大鼠進(jìn)行陰道涂片。將無(wú)菌棉簽用生理鹽水浸濕后輕輕插入大鼠陰道內(nèi),順時(shí)針旋轉(zhuǎn) 1圈充分沾取分泌物后,在載玻片上同方向輕輕滾動(dòng) 3次,使分泌物均勻地涂布于載玻片上,待涂片自然晾干后,用 95%乙醇固定 15m in后,采用巴氏染色法,在顯微鏡下觀察并判定其性周期,以判定造模的成功與否;連續(xù)灌胃 5周后,股動(dòng)脈取血并處死大鼠,取出的血在室溫下靜置 2h后,用轉(zhuǎn)速 3000轉(zhuǎn)/分離心 10min取其上清液,用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清中 IGF-1的濃度,取出卵巢,小心剔除脂肪組織,并包埋、切片,用免疫組化檢測(cè)卵巢中 IGF-1R,剔除脫片,組織重疊,切到脂肪組織及輸卵管的切片,在 400倍電鏡下采用同一光線,每系統(tǒng)分析其積分光密度。病理切片用 HE染色,在 100倍光鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用 SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,多樣本之間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one way ANOVA),用±s表示。

2 結(jié) 果 2.1 對(duì)卵巢的病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 鏡下模型組卵巢蒼白,表面見(jiàn)卵泡,但卵泡多呈囊性擴(kuò)張,卵泡內(nèi)含大量漿液性物質(zhì),間質(zhì)過(guò)度增生,有大量閉鎖卵泡和原始卵泡存在,無(wú)成熟卵泡,卵泡較小,無(wú)黃體;給藥組卵巢色澤鮮紅,與模型組比較,病理性囊性卵泡明顯減少,卵泡壁顆粒細(xì)胞排列較密,層次增多,有少量成熟卵泡和黃體生成;正常組卵巢色澤紅潤(rùn),卵泡發(fā)育良好,無(wú)病理性囊性卵泡,有成熟卵泡,表面見(jiàn)較多黃體。

2.2 各組間 IGF-1水平比較

表1 各組間 IGF-1水平統(tǒng)計(jì)結(jié)果比較

2.3 各組間 IGF-1R表達(dá)結(jié)果比較

表2 各組間 IGF-1R表達(dá)統(tǒng)計(jì)結(jié)果比較

3 討 論中醫(yī)認(rèn)為排卵障礙以腎虛為關(guān)鍵,內(nèi)經(jīng)云“腎藏精,主生殖,為先天之本”。卵子是腎所藏之“陰精”,腎陰是其物質(zhì)基礎(chǔ),腎陽(yáng)是其生長(zhǎng)的動(dòng)力。腎精充盛是卵子發(fā)育成熟的前提,腎陽(yáng)保障腎在排卵前只合不開(kāi),發(fā)揮主蟄與主閉藏之功能,使腎藏精而不泄,腎精充盛,卵子發(fā)育成熟,陽(yáng)氣主動(dòng),腎陽(yáng)的鼓動(dòng)使沖任氣血調(diào)暢,卵子正常排出。若腎精不足、腎陽(yáng)虧虛,一方面當(dāng)合不合,卵泡不能發(fā)育成熟,另一方面,當(dāng)開(kāi)不開(kāi),不能作為內(nèi)在動(dòng)力鼓動(dòng)卵子排出,從而出現(xiàn)卵子排出障礙。行,沖任脈絡(luò)不暢,阻滯胞宮胞脈,也會(huì)導(dǎo)致卵子排出受阻。故卵子的發(fā)育成熟及排出與腎精充盛、腎陽(yáng)鼓動(dòng)密切相關(guān)。故中醫(yī)治療常以補(bǔ)腎為主,兼調(diào)補(bǔ)沖任氣血,效果顯著。

而通脈大生片是由杜仲、續(xù)斷、桑寄生、肉蓯蓉、紫河車、茯苓、山藥、枸杞、首烏、臺(tái)烏、當(dāng)歸、荔枝核、車前仁等十七味中藥組成,方中用紫河車、肉蓯蓉、杜仲、續(xù)斷溫補(bǔ)腎陽(yáng),血肉有情之品直入下焦 ,填奇經(jīng)之精,補(bǔ)奇經(jīng)之氣;配以枸杞子、首烏、當(dāng)歸養(yǎng)肝陰,補(bǔ)益奇經(jīng)之血;輔以山藥、茯苓、車前仁、桑寄生健脾利濕,調(diào)理脾胃,當(dāng)歸、臺(tái)烏、荔枝核活血行氣,通其脈絡(luò) ,共奏通補(bǔ)之效。全方具有溫腎填沖,調(diào)補(bǔ)氣血,通暢脈絡(luò)的作用。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)卵巢排卵,既受下丘腦-垂體-卵巢軸的調(diào)控,也受卵巢局部微環(huán)境特別是非固醇網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控,即卵巢的自分泌-旁分泌系統(tǒng)在卵巢局部發(fā)揮微調(diào)節(jié)作用。參與這一過(guò)程的自分泌和旁分泌因子很多,其中胰島素生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)已被證實(shí)參與卵巢的局部調(diào)節(jié)[2-4]。

自從 1978年 Rinderknek t和 Humbel首先純化 IGF-1和IGF-2后 ,人們發(fā)現(xiàn)卵巢可以產(chǎn)生 IGFs,而 IGFs可以獨(dú)立或協(xié)同促性腺激素調(diào)節(jié)卵巢周期性優(yōu)勢(shì)卵泡選擇、排卵、性激素合成等。目前研究認(rèn)為介導(dǎo)胰島素生長(zhǎng)因子家族的生理功能的主要是 IGF-1和 IGF-1R發(fā)揮的[5,6],且 IGF-1是卵巢局部調(diào)節(jié)系統(tǒng)中重要的生長(zhǎng)因子[7-8],IGF-1除可刺激黃體顆粒細(xì)胞產(chǎn)生E2和 P,還可以協(xié)同 LH進(jìn)一步促進(jìn)雄激素的合成和分泌,使雄激素水平升高[9]。因此,卵巢內(nèi) IGF-1的過(guò)度表達(dá),可導(dǎo)致雄激素合成過(guò)多,進(jìn)而導(dǎo)致卵泡過(guò)早發(fā)育、卵泡膜過(guò)度增生,成為不易破裂的囊泡,進(jìn)而影響卵泡的成熟和排卵。IGF-1R在卵巢顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞和黃體細(xì)胞中均含有。原位雜交表明,IGF-1Rm RNA主要在顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞中表達(dá)。在大鼠中,經(jīng) IGF-1處理培養(yǎng)的大鼠顆粒細(xì)胞能夠提高 1型 IGF受體的表達(dá)[10]。 IGF-1的大部分細(xì)胞效應(yīng)通過(guò) IGF-1R實(shí)現(xiàn)[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)模型組血清內(nèi) IGF-1水平以及卵巢局部 IGF-1R的表達(dá)明顯高于正常組。該結(jié)果提示 IGF-1/IGF-1R過(guò)高可以導(dǎo)致排卵障礙,而通過(guò)給藥,高劑量通脈大生片可降低大鼠血清內(nèi) IGF-1水平和卵巢局部 IGF-1R表達(dá),低劑量通脈大生片可降低 IGF-1R的表達(dá)。說(shuō)明通脈大生片可以通過(guò)降低 IGF-1/IGF-1R促進(jìn)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育和排出。而克羅米芬并不能降低血清 IGF-1水平和卵巢局部 IGF-1R的表達(dá),提示克羅米芬促排卵的機(jī)制可能不是通過(guò)調(diào)節(jié) IGF-1/IGF-1R起作用的。同時(shí),在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)中劑量通脈大生片對(duì)過(guò)高的 IGF-1/IGF-1R不敏感,考慮可能與給藥濃度、樣本量、給藥時(shí)間等因素有關(guān)。而通脈大生片是如何達(dá)到降低 IGF-1/IGF-1R,是通過(guò)性腺軸,還是有其它因子的參與,需進(jìn)一步深入研究。

[1] 魏美娟,俞 瑾.雄激素致高胰島素與高雄激素性無(wú)排卵大鼠模型[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志,1993,2(4):216.

[2] 陳芷玲.調(diào)經(jīng)促排助孕湯治療無(wú)排卵性不孕癥 32例[J].實(shí)用中醫(yī)雜志,2002,18(4):14.

[3] 王志俊.255例不孕癥臨床觀察 [J].新中醫(yī),1995,27(5):37-38.

[4] 王奎武,李 娜,杜 平,等.李廣文教授治療無(wú)排卵性不孕癥 54例經(jīng)驗(yàn) [J].河南中醫(yī),1995,15(3):154.

[5] Rubin R.Basrega.Insulin-like grow th factor-I receptor.Its roles incell proliferation.apoptosis.,and tumorigenicity.Lab Invest 1995,73(3):311-331.

[6] Yu H,Rohan T.Role of insulin-like grow th factor fam ily in cancer development and p rogression.JNatl Cancel Inst 2000,92(18):1472-1489.

[7] 夏 天,沈 嶸,侯莉莉,等.補(bǔ)腎調(diào)沖方對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖與分泌及其 IGF-1 m RNA表達(dá)的影響 [J].遼寧中醫(yī)雜志,2006,33(9):1084.

[8] GintherOJ,Bergfelt DR,BegM A,et al.In vivo effects o f an intrafollicular injection o f insu lin-like grow th factor onthemechanismo f follicledeviation inheifers andmares[J].Biol Rep rod,2004,70(1):99.

[9] 王治鴻.多囊卵巢綜合征高雄激素血癥的形成[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)?婦產(chǎn)科學(xué)分冊(cè),2001,28(3):167.

[10] deM oura M D,Chamoun D,Resnick CE.Insu linlike grow th factor(IGF)-Istimu lates IGF2-Iand type 1 IGF receptorexpressioninculturedratgranulosacell:autoc rineregu lation of the intrafo llicu lar IGF2-I system.Endocrine,2000,13:103-110.

[11] Barnes RB,Namnoum AB,Rosenfield RL,etal.The role of LH and FSH in ovarian and rogen sec retion and ovarian follicular development:clinical studies in a patient with isolated FSH deficiency and malticyatic ovaries[J].Hum Rep rod,2002,17:88-91.