鄒 琳 ，潘秀頡 ，吳維佳 ，劉姜瑾 ，徐 龍 ，楊陟華 ，周冀衡 ，朱茂祥

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草科學(xué)與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；3.湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司公司技術(shù)中心，湖南 長沙 410014）

自1975年鼠傷寒沙門氏菌突變試驗(yàn)（Ames試驗(yàn)）創(chuàng)建以來[1]，國內(nèi)外發(fā)表了大量科學(xué)文獻(xiàn)，確認(rèn)Ames試驗(yàn)為一種簡便快速初篩環(huán)境誘變劑或致癌物的方法。目前，其已成為在世界范圍內(nèi)基因毒性測試中應(yīng)用最為廣泛的一種方法，通常是體外毒理學(xué)測試的第一步[2]。此方法在創(chuàng)建伊始就檢出卷煙煙氣凝聚物具有致突變性[3-4]。2002年，國際煙草科學(xué)研究合作中心（CORESTA）卷煙煙氣體外毒性測試工作組推薦采用此方法評價(jià)卷煙產(chǎn)品的相對毒性[5]。

傳統(tǒng)Ames試驗(yàn)采用平板法，存在敏感性低的缺點(diǎn)。1976年Green等通過改良Ames試驗(yàn)發(fā)明了波動試驗(yàn)（Fluctuation test）[6]，有研究表明該方法的靈敏度比Ames試驗(yàn)高100倍[7-8]。1978年Gatehouse又將其改進(jìn)為微量波動試驗(yàn)方法（Microtitre fluctuation test），并已證明此方法更為靈敏[9]。筆者采用微量波動試驗(yàn)方法和傳統(tǒng)的Ames平板滲入法檢測了4種卷煙煙氣凝聚物致突變性，以考察不同烤煙原料的致突變性、不同添加劑添加量對卷煙致突變性的影響和微量波動試驗(yàn)在卷煙煙氣毒理學(xué)評價(jià)中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)所用非商品卷煙均由湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心提供。共4個(gè)處理，其中1號煙和2號煙為同一產(chǎn)地烤煙制成的單料卷煙，其中1號煙的原料為B2F，2號煙的原料為X3F；3號煙和4號煙為同一葉組配方卷煙，但2種煙的某一添加劑的添加量不同。

1.2 儀器設(shè)備與試劑

1.2.1 主要儀器設(shè)備 JJ100型單通道吸煙機(jī)（由中國煙草總公司鄭州煙草研究院生產(chǎn)）；YJ-875凈化工作臺（蘇州工業(yè)園區(qū)三興凈化科技有限公司），MLS-3020高壓滅菌鍋（SANYO公司），101A-3型干燥箱（上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠）；電熱恒溫水浴鍋（北京長風(fēng)儀器儀表公司）；低溫冰箱（Thermo Format公司）；低溫高速離心機(jī)（KUBOTA公司）；DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2.2 主要試劑 牛肉膏（Ausable），胰胨（OXOID），葡萄糖-6-磷酸鹽（SIGAMA），氧化性輔酶-Ⅱ（ROCHE），組氨酸（SIGAMA），生物素（SIGAMA），氯化鈉，磷酸氫二鈉，氯化鉀，氯化鎂，磷酸氫鈉銨，檸檬酸，磷酸氫二鉀，硫酸鎂，溴甲酚紫。

1.3 卷煙煙氣凝聚物（CSC）的制備

設(shè)定JJ100型單通道吸煙機(jī)的抽吸周期為60 s、抽吸時(shí)間為2 s，連接好密封的兩個(gè)玻璃氣體采樣器，第一個(gè)氣體采樣器內(nèi)盛有95%的乙醇5.0 mL，第二個(gè)氣體采樣器內(nèi)盛有5.0 mL蒸餾水，點(diǎn)燃香煙，將卷煙的煙氣導(dǎo)入氣體采樣器管，然后按設(shè)定的速率，連續(xù)收集10支卷煙。待最后一支吸完，氣體采樣器管內(nèi)氣體完全吸收后，將兩管中的收集液混在一起，并用乙醇洗滌氣體采樣器，與前混合液混和在一起，定容至10.0 mL容量瓶中，搖勻后分裝在0.5 mL EP管中，放至液氮罐中儲藏。此CSC的濃度為1.0支煙/mL。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 試驗(yàn)菌株 選取對卷煙煙氣敏感的TA98和TA100兩個(gè)菌株[10]，試驗(yàn)前均經(jīng)性狀鑒定合格。

1.4.2 微粒體酶制備 用Aroclor 1254誘導(dǎo)大鼠按AMES法制備S9混合液。

1.4.3 平板滲入法 在預(yù)先保溫45℃的2 mL軟瓊脂中加入0.1 mL CSC，0.1 mL測試菌株，0.5 mL S9混合物，充分混勻后倒入底層培養(yǎng)基上鋪平[11]。每一個(gè)試驗(yàn)樣品做3個(gè)平皿，每皿CSC加入量分別為 6.25、12.50、25.00、50.00 μL。最后將試驗(yàn)平皿放入溫箱內(nèi)，37℃培養(yǎng)48 h，分別記錄回變菌落數(shù)并取其平均值。

1.4.4 微量波動法 96孔板中每孔加入50 μL含500個(gè)細(xì)菌的受試菌混合物（1×Vogel-Bonner鹽緩沖液，16 g/L葡萄糖，0.002 g/L組氨酸，0.000 3 g/L生物素，0.024 mol/L磷酸鹽緩沖液，0.006 6 mol/L氯化鉀，0.001 6 mol/L氯化鎂，0.001 mol/L葡萄糖－6－磷酸，0.000 8 mol/L輔酶Ⅱ，2%肝S9液及相應(yīng)濃度受試物）。各受試物分別采用6.25、12.50、25.00、50.00 μL/板濃度進(jìn)行測試，每種濃度每種菌接種48個(gè)孔，37℃孵育16 h后加入選擇培養(yǎng)基150 μL（1×Vogel-Bonner鹽緩沖液，8 g/L 葡萄糖，0.006 7g/L溴甲酚紫），繼續(xù)培養(yǎng)72 h后觀察，孔內(nèi)培養(yǎng)物由紫色變?yōu)辄S色為陽性[12-14]。

1.4.5 結(jié)果判定 計(jì)數(shù)每種菌每種CSC每個(gè)濃度的突變菌落數(shù)或陽性孔數(shù)，以濃度為橫坐標(biāo)，突變菌落數(shù)或陽性孔數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，比較不同樣品的相對毒性。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種Ames試驗(yàn)方法測定4種卷煙CSC致TA98菌突變性結(jié)果

圖1 平板滲入法和微量波動法測定4種卷煙CSC對TA98菌株的致突變結(jié)果

分別用平板滲入法與微量波動法檢測4種卷煙樣品CSC對鼠傷寒沙門氏菌TA98菌株的致突變性，結(jié)果如圖1所示，對同一卷煙樣品，2種Ames試驗(yàn)方法檢測的卷煙煙氣細(xì)菌致突變性均有良好的劑量效應(yīng)關(guān)系。4種不同樣品的卷煙，2種Ames試驗(yàn)方法檢測的卷煙煙氣細(xì)菌致突變性結(jié)果一致，即2號卷煙對TA98菌的致突變性最低，1號和3號卷煙相當(dāng)，4號卷煙最高。進(jìn)一步分析2種檢測方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，線性范圍和劑量效應(yīng)曲線如表1所示，與傳統(tǒng)的平板法計(jì)數(shù)結(jié)果比較，微量波動法檢測結(jié)果的線性范圍更寬，單位劑量致突變率更低，表明試驗(yàn)的靈敏性更高（為平板法的2倍以上）。

表1 平板滲入法和微量波動法測定4種卷煙CSC對TA98菌株的致突變性結(jié)果分析比較

2.2 2種Ames試驗(yàn)方法測定4種卷煙CSC致TA100菌突變性結(jié)果

圖2 平板滲入法和微量波動法測定4種卷煙CSC對TA100菌株的致突變結(jié)果

分別用平板滲入法與微量波動法檢測4種卷煙樣品CSC對鼠傷寒沙門氏菌TA100菌株的致突變性，結(jié)果如圖2所示，與TA98菌的檢測結(jié)果相似，2種Ames試驗(yàn)方法檢測的卷煙煙氣細(xì)菌致突變性結(jié)果一致，即1號和2號卷煙對TA100菌的致突變性相當(dāng)，3號卷煙居中，4號卷煙最高。進(jìn)一步分析2種檢測方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，線性范圍和劑量效應(yīng)曲線如表2所示，與傳統(tǒng)的平板法計(jì)數(shù)結(jié)果比較，微量波動法檢測結(jié)果的線性范圍更寬，單位劑量致突變率更低，表明試驗(yàn)的靈敏性更高（為平板法的4倍以上）。

表2 平板滲入法和微量波動法測定4種卷煙CSC對TA100菌株的致突變性結(jié)果分析比較

3 討論

傳統(tǒng)的Ames平板滲入法采用半固體培養(yǎng)液，在有外源致突變物存在的情況下，組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌發(fā)生回復(fù)突變，回復(fù)為野生型，可在無組氨酸的培養(yǎng)基生長。故可根據(jù)菌落形成數(shù)量，檢查受試物是否為致突變物[15]。微量波動試驗(yàn)（Microtitre fluctuation test）的基本原理與傳統(tǒng)Ames試驗(yàn)相似，不同的是在微量波動實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)系統(tǒng)采用液體培養(yǎng)基，在96孔板中培養(yǎng)，并通過細(xì)菌代謝產(chǎn)物導(dǎo)致培養(yǎng)基酸堿性變化，用酸堿指示劑進(jìn)行結(jié)果檢測。外源化合物致突變能力越強(qiáng)，變色的孔數(shù)越多。微量波動法的全液體測試環(huán)境使得S9及受試物等在測試環(huán)境下仍可繼續(xù)作用一定的時(shí)間，從而使得可誘變受試菌的代謝物增加，Ames突變率增加，增強(qiáng)靈敏性。

本實(shí)驗(yàn)采用微量波動法和平板滲入法分別測定了4種供試卷煙CSC的致突變性。結(jié)果顯示，隨著CSC加入量的增加，2種方法測定的突變性均呈劑量依賴性的增強(qiáng)。表明微量波動法測定的結(jié)果與平板滲入法測定的結(jié)果具有一致性，微量波動法應(yīng)用于卷煙的安全性評價(jià)具有一定的可靠性和實(shí)用性。而從結(jié)果中可以看出，對于致突變性相近的CSC，平板滲入法在受試物較高濃度才能顯示出差別，而微量波動法在受試物低濃度時(shí)就可表現(xiàn)出明顯差異，表明微量波動法相對于平板滲入法在進(jìn)行卷煙安全性評價(jià)中具有靈敏度高的特點(diǎn)。

通過平板滲入法和微量波動法的測定，1號煙（B2F）和2號煙（X3F）烤煙的致突變性存在顯著差異，1號（B2F）烤煙的致突變性明顯大于2號（X3F）烤煙。實(shí)驗(yàn)表明通過合理的選擇葉組配方，能夠在一定程度上降低卷煙產(chǎn)品的致突變性，提高卷煙產(chǎn)品的安全性。對于采用同一葉組配方的卷煙產(chǎn)品，某一種添加劑添加量的不同也會造成其致突變性的差異，合理的選擇煙用添加劑及其用量對于降低卷煙產(chǎn)品的危害性具有一定意義。

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