陳陽婷 ，寧 紅 ，張 敏

（1.成都農林科學院園藝研究所，四川 成都 610072；2.四川省植物檢疫站，四川 成都 610041；3.四川農業(yè)大學，四川 雅安 625014）

快速診斷馬鈴薯病毒病是種薯品質鑒定的重要內容。在我國，主要的馬鈴薯病毒種類有馬鈴薯X病毒（Potato virus X，PVX），馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY），馬鈴薯卷葉病毒（Potato leaf roll virus，PLRV），馬鈴薯 A 病毒（Potato virus A，PVA）及馬鈴薯S病毒（Potato virus S，PVS）。對生產影響最大的病毒是PVY和PLRV，其次是PVX和PVA，PVS影響較小[1]。通過3 a田間調查及分子檢測，發(fā)現在四川地區(qū)，PVX、PVS、PVA及PLRV往往復合侵染，迫切需要經濟方便的多重檢測方法。本研究設計了這4種病毒的引物，從退火溫度、反轉錄反應中dNTPs濃度、PCR反應中Mg2+濃度、循環(huán)條件4方面優(yōu)化反應條件。優(yōu)化后的三重RT-PCR反應體系，可以同時檢測田間復合侵染的3種馬鈴薯病毒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從田間采集感染有馬鈴薯病毒的發(fā)病植株，以ELISA方法確定病毒種類，分別將PVX、PVS、PLRV和PVA混合接種于防蟲溫室內種植的健康馬鈴薯植株上，以植物組織培養(yǎng)室內經過莖尖脫毒的馬鈴薯組培苗作為陰性對照。

1.2 病毒RNA的提取

采用北京TIANGEN生化科技有限公司的RNAprep Plant Kit試劑盒提取帶毒馬鈴薯植株的總RNA作為待測的病毒RNA。

1.3 cDNA的合成

根據 PVX、PVS、PVA以及 PLRV的基因組RNA保守序列設計特異性引物對（表1）。反轉錄體系（20 μL）：病毒總 RNA 2.5 μL，20 pmol/L 病毒下游引物各0.5 μL，5×MMLV buffer（MBI）4 μL，20 U/μL RNA 抑制劑 （Rnasin，MBI）0.5 μL，200 U/μL MMLV 反轉錄酶（MMLV RT，MBI）1 μL，dNTPs分別選用 0.5、1、1.5 mmol/L，DEPC 處理水補足 20 μL。反轉錄條件：42℃ 30 min，94℃ 5 min，4℃保存。擴增反應在eppendorf PCR擴增儀中進行。

表1 用于RT-PCR反應的4種馬鈴薯病毒引物對

1.4 PCR反應

RCR 體系（總體積 25 μL）：取 4 μL合成的cDNA 作為反應模板，10×PCR buffer（BioBRK）2.5 μL，5 u/μL Taq DNA 聚合酶 （BioBRK）0.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，MgCl2分 別 選 用 2.5、3、3.5 mmol/L，20 pmol/L 4種病毒上游引物和下游引物各1 μL，雙蒸水補足 25 μL。退火溫度從 57℃設到61℃；PCR反應條件是94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸 1 min，設置為 30 個循環(huán)、35 個循環(huán)、40個循環(huán)、45個循環(huán)，最后72℃延伸10 min；PCR反應在eppendorf PCR擴增儀中進行。PCR反應結束后，取出擴增產物5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 三重RT-PCR的組合

三重 RT-PCR檢測 PVX、PVS、PVA和 PLRV共有 4種組合方式，分別是：（1）PVX、PVS和 PVA；（2）PVX、PVS 和 PLRV；（3）PVX、PVA 和 PLRV；（4）PVS、PVA和PLRV。每一種組合的反應體系都從dNTPs濃度對反體轉錄的影響、退火溫度對PCR的影響、Mg2+濃度對PCR的影響和反應程序對PCR的影響4個方面進行優(yōu)化。

1.6 RT-PCR產物的克隆和測序

RT-PCR產物切膠回收后，按標準方法克隆到PGM-T中，PCR法篩選陽性菌落，提取質粒DNA，酶切驗證后分別測序（上海英俊生物技術有限公司）。

2 結果與分析

2.1 反轉錄（RT）

反轉錄體系中dNTPs濃度為0.5、1、1.5 mmol/L時，對三重RT-PCR同時檢測PVX、PVA和PLRV的影響如圖1-A所示，當dNTPs小于1 mmol/L，PVA擴增靶帶很弱；當dNTPs濃度為1～1.5 mmol/L時能擴增出PVX、PVA、PLRV這3種病毒的靶標條帶；當dNTPs濃度為1.5 mmol/L時，擴增效果最好。三重RT-PCR同時檢測PVS、PVA和PLRV的影響如圖1-B所示，dNTPs濃度為0.5～1.5 mmol/L都能擴增出3種病毒條帶。

圖1 dNTPs濃度的優(yōu)化

本試驗采用的是兩步法二重RT-PCR，首先反轉錄合成cDNA，然后取一部分cDNA進行PCR擴增。如果反轉錄沒有合成cDNA或合成的較少，將直接影響到PCR擴增的效果，所以反轉錄反應相對較為重要[1]?？芍琩NTPs濃度是影響反轉錄反應重要的因素。

2.2 聚合酶鏈式反應（PCR）

2.2.1 退火溫度對PCR的影響 如圖2-A所示，退火溫度從58℃到62℃都能同時擴增出PVX、PVS、PLRV 3種病毒；從圖2-B可知，當退火溫度達到61℃時，三重RT-PCR僅能擴增出PVS和PVA兩種病毒。當退火溫度為60℃時，病毒的三條靶標條帶清晰且亮度高，擴增效果最好。所以，退火溫度對PCR也有一定的影響。

圖2 退火溫度的優(yōu)化

2.2.2 Mg2+濃度對PCR的影響 PCR體系中Mg2+濃度為2.5、3.0、3.5 mmol/L時，對三重RT-PCR同時檢測PVA、PVY和PLRV的影響如圖3-A所示，當Mg2+濃度為2.5 mmol/L時，無法擴增出PVA，只能擴增出PVS和PLRV的靶標條帶；當Mg2+濃度增為3 mmol/L，能同時擴增出PVS、PVA、PLRV 3種病毒的靶標條帶；再繼續(xù)增大Mg2+濃度，對3種病毒的擴增效果不好。如圖3-B所示，Mg2+濃度為2.5、3.0、3.5 mmol/L 時，都能同時擴增出 PVX、PVS、PVA的靶標條帶，當Mg2+濃度增為3 mmol/L，擴增效果最好。因此，Mg2+濃度對PCR擴增的影響較大。

圖3 MgCl2濃度的優(yōu)化

2.3 反應程序

如圖4-A所示，PCR的循環(huán)數從30到45均能同時擴增出PVX、PVS和PVA，但是當循環(huán)數目小于30時，PVA的目的條帶不明顯；當循環(huán)數目大于40時，PVA的目的條帶非常微弱；效果較好的是35個循環(huán)。從圖4-B，可知PCR的循環(huán)數從30到45均能同時擴增出PVX、PVA和PLRV，擴增效果差異不大?？偟膩碚f，反應程序對整個反應影響不大。

圖4 循環(huán)次數的優(yōu)化

2.4 RT-PCR產物的克隆及測序

切膠回收 PVX、PVS、PVA和 PLRV的 RTPCR產物，克隆到PGM-T載體中，通過PCR驗證得到的白色菌落分別含有以上幾種病毒的cDNA，提取質粒測序。測序結果與NCBI BLAST報道的病毒基因序列對比，PLRV的RT-PCR擴增產物的序列與NCBI BLAST報道的相應病毒的序列同源性達到100%；PVA的RT-PCR擴增產物的序列與NCBI BLAST報道的PVA病毒的序列同源性達到99%；PVS的RT-PCR擴增產物的序列與NCBI BLAST報道的PVS病毒的序列同源性達到98%；PVX的RT-PCR擴增產物的序列與NCBI BLAST報道的PVX病毒的序列同源性達到96%。

3 討論

傳統(tǒng)的指示植物法檢測病毒費時費力且靈敏度低，目前應用最廣的是以病毒抗血清為基礎的酶聯免疫法（ELISA）檢測病毒。ELISA法比傳統(tǒng)的檢測方法靈敏度提高了許多，但存在著假陽性或假陰性現象，也無法區(qū)分因外殼蛋白基因有一定同源性的病毒類型[2]，并且不足以檢測含量極少的韌皮部病毒及休眠種薯中的病毒。近年來發(fā)展的反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法因其具有靈敏、快速、特異性強等優(yōu)點，在植物病毒的檢測上顯示出強大的優(yōu)勢[3]。在國內外已有單一RT-PCR檢測PVY、PLRV、PSTVd等的應用。

在RT-PCR中使用一對以上的引物就稱之為多重RT-PCR，它能夠同時擴增目的DNA中的幾個片段，以節(jié)省模板、時間和減少費用。設置多重PCR反應體系必須確保反應中所有的引物有相近的熔解溫度，擴增產物應該大小相近但又能夠通過電泳分開。本研究設計的這4種病毒的引物，基本滿足以上條件；并且從退火溫度、dNTPs濃度、Mg2+濃度、循環(huán)條件4方面優(yōu)化反應條件，將其應用于同時擴增3種病毒已成功實現。與單重RT-PCR相比，三重RT-PCR更適合于檢測田間復合侵染的多種病毒，可以大大簡化病毒檢測的工作量，又能進一步降低成本，更有利于馬鈴薯種苗病毒實際檢測，對于生產實踐有著非常重要的意義。研究結果表明，采用該反應程序可以穩(wěn)定性地檢出田間自然感染的幾種主要馬鈴薯病毒。并可以此研究結果為基礎，對反應體系做進一步的優(yōu)化，建立四重RTPCR同時檢測多種馬鈴薯病毒的技術。

[1]袁 青，殷幼平，王中康.二重RT-PCR快速檢測馬鈴薯病毒的方法[J].植物檢疫，2005，19（3）：135-138.

[2]Jelkmann W,Keimkonrad R.An immuno-capture polymerase chain reaction and plate-trapped ELISA for the detection of apple stem spitting virus[J].Phytopathology,1997,145:499-504.

[3]李浩戈，吳元華，趙秀香.馬鈴薯Y病毒的RT-PCR檢測[J].沈陽農業(yè)大學學報，1990；30（3）：244-246.