朱向濤，王 雁，彭鎮(zhèn)華，律春燕，鄭寶強(qiáng)，高云瑞

（中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，國(guó)家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)試驗(yàn)室，北京 100091）

牡丹（Paeonia suffruticosaAndr.），屬芍藥科芍藥屬的名貴觀賞和藥用木本植物[1]，冠有“花中之王”美譽(yù)[2]。牡丹的組織培養(yǎng)研究已經(jīng)有較長(zhǎng)的歷史，近年來(lái)也取得了一定進(jìn)展。但在牡丹花藥誘導(dǎo)愈傷組織方面仍然存在愈傷組織誘導(dǎo)困難、誘導(dǎo)率低、生長(zhǎng)緩慢等問(wèn)題[3-6]。關(guān)于花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)率低的原因有很多，而花粉的發(fā)育時(shí)期是影響培養(yǎng)效果的重要因素之一，這在其他植物上如番茄[7]、黃瓜[8]、金銀花[9]已有較詳細(xì)的研究報(bào)道，而牡丹花粉的發(fā)育時(shí)期與花蕾大小相關(guān)性及其愈傷組織誘導(dǎo)率方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者通過(guò)對(duì)不同花蕾大小的牡丹花粉母細(xì)胞發(fā)育時(shí)期的觀察，探討了花蕾大小與花粉母細(xì)胞發(fā)育時(shí)期的相關(guān)性，并對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的花藥進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，以期通過(guò)花蕾大小的外觀判斷，推斷和確定花粉母細(xì)胞發(fā)育時(shí)期，從而為提高愈傷組織誘導(dǎo)率提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試牡丹品種為“鳳丹”，種植于中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院試驗(yàn)田，田間管理按照常規(guī)方法進(jìn)行。

愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基：MS+2.0 mg/L 2，4-D+1.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA，蔗糖6%，瓊脂0.7%，pH 5.8，121℃高壓滅菌 20 min。

1.2 方法

2008 年 4 月，于晴天上午 10：00～11：00 之間，從生長(zhǎng)良好的植株上選取不同長(zhǎng)度的花蕾，用游標(biāo)卡尺測(cè)量花蕾長(zhǎng)度后，分裝于卡諾氏固定液（無(wú)水乙醇∶冰醋酸=3∶1）固定 24 h，經(jīng) 95%、80%乙醇沖洗后轉(zhuǎn)入70%乙醇中4℃保存?zhèn)溆?。采用醋酸洋紅壓片法壓片，顯微鏡觀察拍照。

每份材料取不同大小10個(gè)花蕾，3次重復(fù)，每個(gè)花蕾取1個(gè)花藥，每個(gè)花藥觀察10個(gè)不同視野，通過(guò)視野中花粉母細(xì)胞發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)比例來(lái)確定花粉母細(xì)胞發(fā)育時(shí)期。并對(duì)不同時(shí)期單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行顯微鏡拍照。

花藥接種時(shí)，自來(lái)水沖洗2 h，2%次氯酸鈉消毒20 min，無(wú)菌水沖洗4～5遍，70%酒精消毒20 s，之后再用無(wú)菌水沖洗4～5遍，用濾紙將多余水分吸干，在無(wú)菌條件下將花藥剝離接種。每處理接種10瓶，3次重復(fù)。接種后的花藥置于在（25±2）℃條件下暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡丹各發(fā)育階段的細(xì)胞學(xué)特征

2.1.1 四分體時(shí)期 如圖1所示，花粉母細(xì)胞經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂形成四分體，四分體的4個(gè)小孢子被共同的胼胝質(zhì)包被，各個(gè)小孢子之間也有胼胝質(zhì)分割。

2.1.2 單核早期 如圖2所示，小孢子從四分體中釋放，細(xì)胞體積小，細(xì)胞質(zhì)中無(wú)液泡，核大，居于中間位置。

2.1.3 單核中期 如圖3所示，細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生小液泡，細(xì)胞體積增加到正常大小，核大，居中央，特化細(xì)胞壁逐步形成，細(xì)胞壁周?chē)霈F(xiàn)萌發(fā)孔。

圖1 四分體時(shí)期

圖2 單核早期

2.1.4 單核晚期 如圖4所示，隨著小孢子的發(fā)育，細(xì)胞質(zhì)液泡化，出現(xiàn)小液泡，小液泡增多相互合并形成大液泡，將細(xì)胞核擠壓到靠近細(xì)胞壁。

圖3 單核中期

圖4 單核晚期

2.1.5 雙核期 如圖5所示，細(xì)胞核在靠近細(xì)胞壁位置進(jìn)行有絲分裂形成兩個(gè)子核，其中一個(gè)較小并貼近細(xì)胞壁，為生殖核，另一個(gè)明顯較大而且處于近中央位置及營(yíng)養(yǎng)核，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞構(gòu)成了二細(xì)胞花粉。

2.2 花蕾長(zhǎng)度與花粉母細(xì)胞發(fā)育的關(guān)系

如表1所示，花蕾長(zhǎng)度在16.0～18.0 mm時(shí)，絕大多數(shù)花粉母細(xì)胞發(fā)育時(shí)期為四分體時(shí)期，有少數(shù)處于單核早期和單核中期，四分體時(shí)期的細(xì)胞數(shù)目占總細(xì)胞數(shù)目的92.4%。

表1 花粉母細(xì)胞發(fā)育時(shí)期與花蕾長(zhǎng)度的相關(guān)性

在花蕾長(zhǎng)度為18.0～20.0 mm時(shí)，多數(shù)花粉細(xì)胞的發(fā)育時(shí)期為單核早期，占到總細(xì)胞數(shù)目的87.5%，有少數(shù)細(xì)胞處于四分體時(shí)期和單核中期，極少數(shù)細(xì)胞已經(jīng)發(fā)育到單核晚期。

花蕾長(zhǎng)度在20.0～23.0 mm時(shí)，多數(shù)花粉細(xì)胞發(fā)育時(shí)期為單核中期，有部分細(xì)胞發(fā)育時(shí)期為單核早期和單核晚期，極少數(shù)細(xì)胞發(fā)育時(shí)期為雙核期，單核中期的細(xì)胞數(shù)目占細(xì)胞總數(shù)的91.5%。

當(dāng)花蕾長(zhǎng)度為23.0～25.0 mm時(shí)，花粉細(xì)胞中多數(shù)細(xì)胞的發(fā)育時(shí)期處于單核晚期，少數(shù)細(xì)胞的發(fā)育時(shí)期為單核早期和單核中期，另外有部分細(xì)胞的發(fā)育時(shí)期為雙核期，單核晚期的細(xì)胞數(shù)目占總細(xì)胞數(shù)目的82.9%。

花蕾長(zhǎng)度為25.0～28.0 mm時(shí)，花粉細(xì)胞中大多數(shù)細(xì)胞處于雙核期，占總細(xì)胞數(shù)目的82.2%，少數(shù)細(xì)胞處于單核中期和單核晚期。

2.3 花藥不同發(fā)育時(shí)期愈傷組織誘導(dǎo)率

由表2可以看出，不同的發(fā)育時(shí)期的牡丹花藥都能誘導(dǎo)出愈傷組織，但誘導(dǎo)率有所不同。從四分體時(shí)期開(kāi)始誘導(dǎo)率逐漸升高，在單核中期達(dá)到最高，其后逐漸降低。單核中期的愈傷組織誘導(dǎo)率為45.8%，其次為單核晚期，誘導(dǎo)率為18.3%。單核早期和雙核期愈傷組織誘導(dǎo)率均為13.3%，四分體時(shí)期愈傷組織誘導(dǎo)率僅為8.3%。誘導(dǎo)出的愈傷組織均為白色致密愈傷組織（圖6）。

表2 花粉不同發(fā)育時(shí)期對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

圖5 雙核期

圖6 花藥誘導(dǎo)的愈傷組織

3 結(jié)論與討論

牡丹花藥培養(yǎng)過(guò)程中，取材時(shí)期具有關(guān)鍵性作用。在大規(guī)模的小孢子培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)顯微鏡觀察每一個(gè)小孢子的發(fā)育時(shí)期是有很大困難的，因此，通過(guò)花蕾長(zhǎng)度來(lái)簡(jiǎn)單的判斷花粉的發(fā)育時(shí)期具有重要的作用。牡丹花粉的發(fā)育時(shí)期包括四分體時(shí)期、單核早期、單核中期、單核晚期和雙核期。在花藥發(fā)育的四分體時(shí)期，植物的花藥尚未發(fā)育完全，不利于誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生，而單核中期，細(xì)胞質(zhì)中小液泡產(chǎn)生，細(xì)胞體積增加到正常大小，特化的細(xì)胞壁逐漸形成，此時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)最為旺盛，營(yíng)養(yǎng)成分也較為充足。另外花粉進(jìn)入單核期后，即將進(jìn)入有絲分裂，此時(shí)花藥對(duì)誘導(dǎo)條件最為敏感，容易引起染色體軸向的改變，導(dǎo)致花粉細(xì)胞進(jìn)行脫分化分裂而開(kāi)始花粉脫分化，所以容易產(chǎn)生愈傷組織。這在觀賞茄[10]、仙客來(lái)[11]、羽衣甘藍(lán)[12]、中國(guó)水仙[13]等植物上也取得了同樣的結(jié)果。單核晚期由于細(xì)胞質(zhì)中的小液泡聯(lián)合成為一個(gè)大的液泡，對(duì)誘導(dǎo)條件反應(yīng)不夠敏感，所以誘導(dǎo)率較低。

本試驗(yàn)確定在花蕾長(zhǎng)度為20.0～23.0 mm時(shí)，牡丹的大多數(shù)花粉母細(xì)胞發(fā)育處于單核中期，此時(shí)期花粉誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)到最高的45.8%。實(shí)踐證明，在牡丹小孢子培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)花蕾大小及形態(tài)特征的觀察，無(wú)需制片鏡檢，即可快速、準(zhǔn)確地找到適合小孢子培養(yǎng)發(fā)的花蕾，可避免每次取樣時(shí)需要制片觀察確定小孢子發(fā)育時(shí)期的繁瑣程序，具有方便、快捷、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，有利于提高小孢子培養(yǎng)的效率。

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