張宇玲，李小容，楊民和

（福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350108）

植物葉片棲居有豐富的真菌群落。人們把附著于葉面并可以定居和增殖的真菌群體稱(chēng)為葉面真菌（fungal epiphytes）[1]；而將寄生于正常生長(zhǎng)植物體內(nèi)的真菌稱(chēng)為內(nèi)生真菌（fungal endophytes）[2]。已有的絕大多數(shù)研究都將葉面真菌和內(nèi)生真菌獨(dú)立進(jìn)行。因此，葉面真菌與內(nèi)生真菌雖然生存的微環(huán)境相距不到1 mm，但人們對(duì)它們的種群結(jié)構(gòu)差異和相互關(guān)系知之甚少。近年來(lái)，由于微生態(tài)學(xué)理論和技術(shù)的飛速發(fā)展，人們逐步認(rèn)識(shí)到植物葉圍（phyllosphere）微生物的種群和互作關(guān)系比人們預(yù)料的要更為復(fù)雜而多樣[3]。

20世紀(jì)70年代以來(lái)，已有一些零星的報(bào)道對(duì)健康植物葉片上葉面真菌和內(nèi)生真菌作了比較研究。日本學(xué)者Osono實(shí)驗(yàn)室對(duì)山茱萸（Swida controversa）、偃伏梾木（Cornus stolonifera）和純齒山毛櫸（Fagus crenata）等植物的葉面真菌和內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離和比較。研究結(jié)果表明，植物葉面和內(nèi)部組織生長(zhǎng)有明顯不同的真菌群落，真菌的定植和分布受生長(zhǎng)季節(jié)和葉片生育期的影響[4～7]。在咖啡（Coffea arabica）的健康葉片上，生長(zhǎng)有豐富的真菌群落，內(nèi)生真菌和葉片真菌的種群差異明顯，交叉分布的種類(lèi)很少；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌的物種多樣性比葉面真菌更為豐富；不同取樣地點(diǎn)的同種植物的葉片中，真菌群落也有差異[3]。相對(duì)于種類(lèi)豐富、生態(tài)類(lèi)型復(fù)雜多樣的植物，這些研究結(jié)果顯然不足于概述植物葉圍真菌的全貌。

茶樹(shù)（Camellia sinensis）是一種重要的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，有關(guān)茶樹(shù)相關(guān)微生物的研究已經(jīng)積累了一些資料。在茶園土壤微生物、茶樹(shù)生長(zhǎng)繁殖與微生物、微生物與茶葉加工貯藏、微生物與茶樹(shù)保護(hù)、微生物與茶的綜合利用等多方面都有相關(guān)的報(bào)道[8]。盧東升等對(duì)茶樹(shù)內(nèi)生真菌的種類(lèi)及分布以及對(duì)豫南茶園樹(shù)棲真菌、芽及葉棲真菌群落及種群演替做了大量調(diào)查，并對(duì)茶園微生物及其應(yīng)用進(jìn)行了很好的總結(jié)[9]。謝麗華等[10]對(duì)茶樹(shù)品種、葉片生育期和茶葉化學(xué)成份對(duì)內(nèi)生真菌的影響做過(guò)報(bào)道。但是，同時(shí)分離茶樹(shù)葉面真菌與內(nèi)生真菌，比較、分析它們的種群結(jié)構(gòu)及其差異，還未見(jiàn)相關(guān)的報(bào)道。本研究對(duì)茶樹(shù)葉面真菌與內(nèi)生真菌進(jìn)行分離和鑒定，以期進(jìn)一步了解其種群結(jié)構(gòu)及微生態(tài)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

從福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)茶園（福州金山）采集健康成熟的葉片，茶樹(shù)品種為黃旦和鐵觀音，在茶園這兩品種相鄰種植。采用五點(diǎn)取樣法，每品種每點(diǎn)分別取健康成熟葉片10片，共50片。成熟葉片指得是當(dāng)年生長(zhǎng)季節(jié)發(fā)出的，葉色嫩綠、角質(zhì)化不明顯的展開(kāi)葉片。樣本編號(hào)后，裝入無(wú)菌紙袋，帶回實(shí)驗(yàn)室后立即進(jìn)行真菌的分離，或?qū)⒅参飿颖敬娣庞?℃冰箱中備用。

1.2 葉面真菌

采用兩種方法分離茶樹(shù)葉面真菌。分離方法1，葉片組織粘附法[3]：將采集的同一品種的茶樹(shù)葉片充分混合，然后隨機(jī)取20片，用直徑為0.5cm的無(wú)菌打孔器取葉片組織塊，從每一葉片隨機(jī)取6個(gè)組織塊，分別接入補(bǔ)加50mg/kg鏈霉素的PDA培養(yǎng)基中，每直徑為9cm的培養(yǎng)皿中放入6～8個(gè)組織塊（3～4塊近軸面朝下），置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，再在無(wú)菌條件下將葉片組織塊移出培養(yǎng)皿。將移走葉片組織塊的培養(yǎng)皿放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待出現(xiàn)菌落時(shí)，按菌落形態(tài)的不同，挑取少量菌絲進(jìn)行分離純化。分離方法2，稀釋平板法：將采集來(lái)的同一品種的茶樹(shù)葉片混合，分別選取形狀大小相近的茶樹(shù)葉片10片，置于盛有100ml無(wú)菌水的三角瓶?jī)?nèi)，強(qiáng)力、反復(fù)振蕩15min后，制得菌懸液，稀釋10、100、1000倍3個(gè)不同濃度，用無(wú)菌吸管吸取0.2ml接種到PDA平板中，每個(gè)濃度梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)，涂抹均勻后置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)；待菌落長(zhǎng)出后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)并挑取單菌落于PDA平板上純化培養(yǎng)，用于菌類(lèi)的鑒定。

1.3 內(nèi)生真菌分離

內(nèi)生真菌的分離參見(jiàn)謝麗華等[10]的方法。待葉片組織周?chē)霈F(xiàn)菌體時(shí)，進(jìn)行分離純化。

1.4 真菌形態(tài)鑒定

由于分離獲得的部分真菌在常規(guī)培養(yǎng)條件下不產(chǎn)生繁殖體，按其在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況和菌落形態(tài)劃分為不同的形態(tài)型（morphospecies）。誘導(dǎo)產(chǎn)孢的方法如下：分離純化的真菌移接到PDA培養(yǎng)基或經(jīng)高壓滅菌的茶葉上，在28℃恒溫、黑暗條件下培養(yǎng)。至菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后，將培養(yǎng)皿取出，放置于室溫下繼續(xù)培養(yǎng)；或在無(wú)菌條件下用接種環(huán)輕刮菌絲表面，誘導(dǎo)真菌產(chǎn)生孢子。培養(yǎng)期間注意觀察真菌生長(zhǎng)特征，隨時(shí)進(jìn)行照相記錄。對(duì)在人工培養(yǎng)條件能產(chǎn)孢的真菌，參照魏景超和陸家云等的相關(guān)專(zhuān)著，進(jìn)行真菌屬的初步鑒定；選擇優(yōu)勢(shì)種真菌（分離率≥30%）采用ITS序列分析鑒定。

1.5 優(yōu)勢(shì)真菌ITS序列分析

1.5.1 基因組DNA的提取 參照武漢琴等（2009）的方法進(jìn)行。

1.5.2 rDNA-ITS的擴(kuò)增與序列測(cè)定 nrDNA ITS區(qū)用引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′和ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，按程序：95℃預(yù)變性5 min；接以95℃30s，56℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃保溫7min進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物由上海生工生物工程有限公司合成。擴(kuò)增的反應(yīng)體系（ 25μl）：超純水16.75μl，10×Buffer2.5μl，2mmol/L dNTP2.5μl，10μmol/L ITS4 1μl，10μmol/L ITS5 1μl，Taq酶0.25μl，模板1μl。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收、純化后送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.5.3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 以每個(gè)菌株的ITS和5.8S序列作為靶序列，在GenBank中用BLAST程序搜索同源序列，挑選與菌株序列相近的參考序列用于系統(tǒng)發(fā)育分析。利用Bioedit軟件編輯，Clustalx軟件將序列匹配排列，phylip3.67構(gòu)建ITS系統(tǒng)樹(shù)，選用鄰接法（Neighbor-joining）分析，每次搜索進(jìn)行隨機(jī)1 000次重復(fù)，獲得的自展檢驗(yàn)（bootstrap）數(shù)值標(biāo)記在分支上。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

葉面真菌和內(nèi)生真菌的分離率按以下公式進(jìn)行：

數(shù)據(jù)的顯著性分析采用t-檢驗(yàn)：雙樣本等方差假設(shè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹(shù)葉面真菌與內(nèi)生真菌多樣性

采用常規(guī)葉部真菌分離方法，依據(jù)PDA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)的差異，從茶樹(shù)品種黃旦葉片上分離得到葉面真菌共26種形態(tài)型，其中15種在PDA培養(yǎng)基上能產(chǎn)生或誘導(dǎo)產(chǎn)生繁殖體；內(nèi)生真菌18種形態(tài)型，其中6種在PDA培養(yǎng)基上能產(chǎn)生或誘導(dǎo)產(chǎn)生繁殖體，葉面真菌與內(nèi)生真菌檢出率分別為100%和87.52%，其中分離率大于3%的共18種形態(tài)型。從茶樹(shù)品種鐵觀音葉片分離到葉面真菌16種形態(tài)型，其中10種在PDA培養(yǎng)基上能產(chǎn)生或誘導(dǎo)產(chǎn)生繁殖體；內(nèi)生真菌15種形態(tài)型，其中7種在PDA培養(yǎng)基上能產(chǎn)生或誘導(dǎo)產(chǎn)生繁殖體，葉面真菌與內(nèi)生真菌檢出率分別為100%和94.27%，其中分離率大于3%的共12種形態(tài)型。人工培養(yǎng)條件下能產(chǎn)生繁殖體的真菌包括擬盤(pán)多毛孢屬（Pestalotiopsis spp.）、芽枝霉屬（Cladosporium sp.）、短梗霉屬（Aureobasidium sp.）、青霉屬（Penicillium spp.）、曲霉屬（Aspergillus sp.）、鐮刀菌屬（Fusarium sp.）、球座菌屬（Guignardia sp.）、刺盤(pán)孢屬（Colletotrichum spp.）的真菌。本研究中，同時(shí)分離獲得一些人工培養(yǎng)條件下不產(chǎn)孢或難于產(chǎn)孢的、未鑒定的真菌。

2.2 優(yōu)勢(shì)真菌鑒定

對(duì)分離率大于30%的6種茶樹(shù)葉圍真菌，在形態(tài)學(xué)觀察的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析其ITS序列，采用鄰接法（Neighbor-joining）構(gòu)建N-J樹(shù)，進(jìn)行初步的鑒定。結(jié)果表明：菌株B1為Pestalotiopsis theae，菌株B2為Cladosporium cladosporioides（GenBank序列號(hào)：FJ216453），菌株B4為Botryosphaeria rhodina（GenBank序列號(hào)：FJ216454），菌株B8為Aureobasidium pullulans（GenBank序列號(hào)：FJ216455），菌株nsy-12為Guignardia mangiferae（GenBank序列號(hào)：EU671077），菌株N13確定為Colletotrichum sp.。

2.3 兩種方法分離葉面真菌比較

采用兩種分離方法均分離到4種相同的優(yōu)勢(shì)種葉面真菌。但從分離所得的真菌總數(shù)上，稀釋平板法所得葉面真菌種類(lèi)（形態(tài)型）少于葉片組織黏附法所獲得的真菌；在茶樹(shù)品種黃旦上，采用稀釋平板法分離到葉面真菌15種形態(tài)型，而采用葉片組織黏附法獲得26種形態(tài)型；在鐵觀音上，采用稀釋平板法分離到葉面真菌12種形態(tài)型，而采用葉片組織黏附法獲得16種形態(tài)型。采用葉片黏附法獲得的4種優(yōu)勢(shì)真菌在茶樹(shù)品種黃旦、鐵觀音中的分離率無(wú)顯著差異（p＜0.01），但采用稀釋平板法分離獲得的Pestalotiopsis theae、Cladosporium cladosporioides、Aureobasidium pullulans在黃旦和鐵觀音中的相對(duì)分離率存在顯著差異（p＜0.01），Botryosphaeria rhodina無(wú)顯著差異（p=0.33）（表1）。同時(shí)，采用不同分離方法，真菌數(shù)量也大不相同，如采用葉片黏附法，Pestalotiopsis theae在黃旦和鐵觀音中的分離率分別為90.57%和96.74%；而采用稀釋平板法，相對(duì)分離率分別只有7.47%和31.11%；其它3種真菌的數(shù)量也存在明顯的差異（表1）。因此，采用不同的葉片表面真菌分離方法，檢出真菌的種類(lèi)和數(shù)量，均表現(xiàn)出明顯的差異。

表1 葉面真菌兩種不同分離方法結(jié)果比較Table 1 Comparison of fungal epiphytes with two isolation methods

2.4 茶樹(shù)葉面真菌與內(nèi)生真菌比較

由表2可知，Pestalotiopsis theae、Cladosporium cladosporioides、Botryosphaeria rhodina、Aureobasidium pullulans等4種真菌為葉面優(yōu)勢(shì)真菌，Guignardia mangiferae、Colletotrichum sp.等為內(nèi)生優(yōu)勢(shì)真菌，其中僅Pestalotiopsis theae為葉面優(yōu)勢(shì)真菌與內(nèi)生真菌所共有，其余葉面優(yōu)勢(shì)真菌均未在內(nèi)生真菌中分離得到，數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明兩群落的真菌組成存在顯著差異。

在葉面真菌中，Pestalotiopsis theae、Cladosporium cladosporioides、Botryosphaeria rhodina和Aureobasidium pullulans均能從同一茶葉組織塊中長(zhǎng)出，特別是Pestalotiopsis theae、Cladosporium cladosporioides和 Aureobasidium pullulans，表現(xiàn)出高度重疊（＞64.10%）；內(nèi)生真菌中，Guignardia mangiferae 和 Colletotrichum sp.可以部分重疊，有22.33%～35.67%的Colletotrichum sp.和Guignardia mangiferae從同一組織塊中同時(shí)長(zhǎng)出。而Pestalotiopsis theae 則一般單獨(dú)長(zhǎng)出（表2）。

表2 茶葉葉面真菌與內(nèi)生真菌優(yōu)勢(shì)種比較Table 2 Epiphytes vs endophytes in the six major fungal species isolated from tea leaves

3 討論

結(jié)果顯示，采用不同的分離方法用于分析真菌的種群數(shù)量和結(jié)構(gòu)，能顯著地改變分離結(jié)果。葉片洗滌后稀釋平板分離法對(duì)那些以孢子粘附在葉面上的真菌計(jì)數(shù)較為準(zhǔn)確，但以菌絲粘附的真菌則難以洗下。而在培養(yǎng)基上黏附一定時(shí)間后移走葉片組織塊，卻能分離到更多種類(lèi)的葉面真菌。從葉片組織黏附法的分離結(jié)果看，移去茶葉組織塊，培養(yǎng)2d后即可見(jiàn)茶擬盤(pán)多毛孢的菌絲大量生長(zhǎng)。因此，在PDA培養(yǎng)基上，茶擬盤(pán)多毛孢具有更強(qiáng)的生長(zhǎng)能力。對(duì)照于稀釋平板法的結(jié)果（表1），可見(jiàn)茶擬盤(pán)多毛孢在茶葉表面的數(shù)量并不比芽枝狀枝孢霉和出芽短梗霉更多，但因生長(zhǎng)能力強(qiáng)，加上組織黏附法對(duì)葉面的真菌沒(méi)有稀釋作用，因而生長(zhǎng)迅速的真菌易造成對(duì)生長(zhǎng)慢的真菌的抑制作用。除少數(shù)情況外[3]，大多數(shù)研究者采用稀釋平板法分離葉面真菌。本研究的結(jié)果表明，采用兩種方法分離、分析植物葉面真菌，各有優(yōu)點(diǎn)。但由于這些方法均依賴(lài)于培養(yǎng)基的篩選作用，因而也存在明顯的缺陷。采用PCR擴(kuò)增和變性梯度膠電泳技術(shù)（DGGE），Yang 等[12]在植物葉片表面洗滌液中檢測(cè)到豐富的微生物群落，其中許多種類(lèi)在人工培養(yǎng)基上難于分離。因此，結(jié)合應(yīng)用人工分離和分子生物學(xué)技術(shù)，能更為全面地反映自然條件下茶樹(shù)葉圍真菌群落結(jié)構(gòu)的真實(shí)情況。

研究結(jié)果表明，茶樹(shù)葉圍維持有豐富的真菌物種多樣性；茶葉表面和內(nèi)部組織中，生長(zhǎng)有完全不同的真菌群落。黃旦葉面真菌與內(nèi)生真菌的種類(lèi)（p＜0.01）與數(shù)量（p＜0.05）均存在顯著不同，在黃旦葉片中葉面真菌的物種多樣性（26種形態(tài)型）遠(yuǎn)大于內(nèi)生真菌物種多樣性（18種形態(tài)型）；而在鐵觀音中，葉面真菌的物種多樣性（16種）與內(nèi)生真菌物種多樣性（15種）差異不大（p=0.55），但各種真菌的數(shù)量存在顯著差異（p＜0.01）（表1，表2）。在茶樹(shù)葉圍占優(yōu)勢(shì)的6種真菌中，芽枝狀枝孢霉、出芽短梗霉和柑桔葡萄座腔菌只存在于茶葉的表面；而芒果球座菌和刺盤(pán)孢菌只生活與茶葉組織內(nèi)。茶擬盤(pán)多毛孢既可生活于茶葉組織內(nèi)，也可生活于茶葉表面（表2）；但茶擬盤(pán)多毛孢在茶葉表面占據(jù)優(yōu)勢(shì)，在茶葉內(nèi)部組織中則分布很少（＜3%）。Santamaria ＆ Bayman[3]對(duì)咖啡葉面真菌與內(nèi)生真菌進(jìn)行了研究，共分離得到內(nèi)生真菌66種，葉面真菌63種，其中僅4種為葉面真菌與內(nèi)生真菌所共有；在葉面真菌中，Botryosphaeria sp.和Pestalotia sp.是優(yōu)勢(shì)種真菌；而在內(nèi)生真菌中，Xylaria sp.、Collerotrichum sp.和 Guignardia sp.是優(yōu)勢(shì)種真菌。在山茱萸（Swida controversa）、純齒山毛櫸（Fagus crenata）和偃伏梾木（Cornus stolonifera）的葉部真菌研究中，也得出相似的結(jié)果[4-7]。Osono[13]從山茶（Camellia japonica）葉片中分離得到真菌共79種，其中葉面真菌52種，內(nèi)生真菌44種，17種為葉面真菌與內(nèi)生真菌所共有；Pestalotiopsis sp.、Cladosporium cladosporioides.、Colletotrichum gloeosporioides、Aureobasidium pullulans等真菌作為優(yōu)勢(shì)種葉面真菌存在，而Geniculosprium sp.、Colletotrichum gloeosporioides 和 C.acutatum.則是內(nèi)生真菌中的優(yōu)勢(shì)種；在優(yōu)勢(shì)種中，只有Colletotrichum gloeosporioides 為葉面真菌和內(nèi)生真菌種群所共有。和本研究的結(jié)果相比較，雖然同為山茶屬植物，茶樹(shù)和山茶葉面真菌的種群組成較為相似，但內(nèi)生真菌的種群組成則很不同。以上分析表明，在植物葉圍，不同物種之間優(yōu)勢(shì)種葉面真菌和內(nèi)生真菌的種類(lèi)可能有不同；但在同一物種葉片上，葉面真菌與內(nèi)生真菌種群的組成均存在顯著的差異。前人研究還顯示，雖然植物葉圍真菌的物種多樣性非常豐富，但優(yōu)勢(shì)種真菌只是少數(shù)幾種[1-7,13]。本研究的結(jié)果支持這一結(jié)論。

研究結(jié)果還顯示，在茶樹(shù)葉圍的優(yōu)勢(shì)真菌中，除茶擬盤(pán)多毛孢可以明確為茶樹(shù)葉部的病原菌，在一定條件下可導(dǎo)致茶樹(shù)輪斑病外，本研究分離獲得的其它葉圍真菌，特別是優(yōu)勢(shì)種真菌，在茶樹(shù)中均未有作為病原菌的記錄[14]。這些真菌可能在維持茶樹(shù)葉圍微生態(tài)平衡和病蟲(chóng)害控制等方面發(fā)揮重要的作用。當(dāng)然，有些真菌也可能是茶樹(shù)的非寄主（non-host）寄生物，在一定條件下能導(dǎo)致其它植物的病害。如芒果球座菌，是熱帶和亞熱帶植物葉部的常見(jiàn)內(nèi)生真菌，寄主范圍非常廣泛，但偶爾也能導(dǎo)致植物的病害[15]。像人體和動(dòng)物腸道微生態(tài)系一樣，植物葉圍微生態(tài)系中微生物的種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量平衡，可能也會(huì)對(duì)植物健康產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。

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