王貽蓮, 司升云, 汪鐘信, 宮成玉, 周利琳

(1.武漢市蔬菜科學(xué)研究所,武漢 430065; 2.山東省科學(xué)院中日友好生物技術(shù)研究中心,濟(jì)南 250014;3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,武漢 430070; 4.煙臺(tái)出入境檢驗(yàn)檢疫局,煙臺(tái) 264000)

蟲酰肼是一種昆蟲生長調(diào)節(jié)劑,能模擬蛻皮激素20-羥基蛻皮酮與目標(biāo)害蟲蛻皮激素受體復(fù)合物相互作用,實(shí)現(xiàn)蛻皮激素的作用方式。到目前為止,國內(nèi)外對(duì)酰肼類殺蟲劑引起甜菜夜蛾抗藥性的研究還較少,僅限于作用機(jī)理、抗性監(jiān)測(cè)等方面,在抗性遺傳及抗性機(jī)制等方面報(bào)道較少[1-3]。為研究甜菜夜蛾對(duì)蟲酰肼的抗藥性機(jī)制,本文采用活體測(cè)定法對(duì)甜菜夜蛾武漢敏感(CK)種群和自然(N)種群進(jìn)行了表皮酚氧化酶(PPO)、乙酰膽堿酯酶(TCE)、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)酶活力測(cè)定,采用PAGE凝膠電泳對(duì)CK種群、汰選種群和N種群的酯酶同工酶(EI)進(jìn)行比較,以期有助于闡明甜菜夜蛾對(duì)蟲酰肼的抗藥性機(jī)制,為甜菜夜蛾抗性治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

甜菜夜蛾武漢自然(N)種群(抗性比25.29)采于武漢市蔬菜科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)田;武漢敏感(CK)種群由武漢市蔬菜科學(xué)研究所無毒飼養(yǎng)多年獲得;處理種群用按一定濕重比混勻蟲酰肼(處理濃度為敏感種群的致死中量0.14 mg/kg)的帶毒飼料飼喂的甜菜夜蛾CK種群;汰選種群由武漢敏感種群開始篩選,共篩選了4～6代。

1.2 供試藥劑及試劑

20%蟲酰肼懸浮劑,美國陶氏益農(nóng)公司;牛血清白蛋白,Roche 分裝 ;固藍(lán) RR 鹽 、α-乙酸萘酯 、β-乙酸萘酯、丙烯酰胺、甘氨酸、β-巰基乙醇、過硫酸銨、溴酚藍(lán)、三羥甲基氨基甲烷、甲叉雙丙烯酰胺,Sigma公司;谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶及乙酰膽堿酯酶測(cè)試盒,南京建成生物工程研究所;其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)。

1.3 蟲酰肼對(duì)甜菜夜蛾六類酶活性測(cè)定

酶樣品制備、測(cè)定方法均嚴(yán)格按測(cè)試盒說明書操作;數(shù)據(jù)用DPS軟件處理系統(tǒng)處理;酶活抑制率計(jì)算公式：

抑制率=(對(duì)照組酶活力-處理組酶活力)/對(duì)照組酶活力×100%;

酯酶同工酶電泳：參照張龍翔方法,采用聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠垂直板電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲酰肼對(duì)甜菜夜蛾 PPO、TCE、GST、SOD和CAT的影響

由表1可知,用混有0.14 mg/kg蟲酰肼的帶毒飼料飼喂CK種群的甜菜夜蛾,在飼喂后24、48 h和72 h測(cè)定酶活力,與不用藥處理的CK種群相比,PPO比活力分別降低79.12%、10.54%和56.23%;SOD比活力分別上升71.59%、63.16%和79.55%;GST比活力在處理后24 h酶活力上升41.43%;TCE和CAT比活力差異不顯著。N種群與不用藥處理的CK種群比,PPO比活力降低38.47%;GST比活力升高34.20%;TCE、CAT和SOD比活力差異不顯著。

表1 處理種群、CK種群和N種群的酶活力比較1)

2.2 酯酶同工酶(EI)電泳

CK種群、N種群和汰選種群的酯酶同工酶電泳結(jié)果見圖1。

由圖1可知,CK種群與N種群、汰選種群的酯酶同工酶差異極顯著,譜帶的數(shù)量、位置、寬度及清晰度均有差異。CK種群酯酶同工酶共15條帶,第2、12、13條帶細(xì)且清晰度差,第5和6、7和8條帶近,不易分開;N種群酯酶同工酶共10條帶,第1、9條帶細(xì)但清晰,第6、7、8、10條帶清晰度差,第1條帶的位置與其他種群的不同;汰選種群酯酶同工酶共10條帶,第1、7、8條帶清晰度差,第3和4、5和6條帶很近,不易分開;汰選種群中的六汰后第2代(六汰F2)酯酶同工酶共14條帶,即在CK種群第11條帶的位置缺失,第2條帶模糊不清,第12條帶清晰度差。

3 討論

研究表明甜菜夜蛾對(duì)蟲酰肼的抗性可能與PPO、EI、GST、SOD 有一定關(guān)系,與 CAT 關(guān)系不大,與TCE無關(guān)。

多酚氧化酶廣泛存在于昆蟲的體壁和血液中,在昆蟲體壁形成的硬化和黑化過程中起重要作用[4-5]。用混有蟲酰肼的帶毒飼料處理試蟲后,處理種群的酶活力均低于CK種群,且在處理后24 h和72 h與CK種群存在顯著差異,表明蟲酰肼很可能可以抑制表皮酚氧化酶酶活力。抗性比為25.29的N種群酶的比活力為9.23A/(mg?min),低于CK種群,且差異顯著,表明N種群的抗性增長與表皮酚氧化酶有關(guān)。Retnakaran報(bào)道,供試?yán)ハx在蛻皮中,蟲酰肼抑制了多巴脫羧酶(DDC)的活性,使羽化激素的釋放受到了抑制[6]。在昆蟲表皮鞣化過程中,多酚氧化酶具有單酚酶活性和二酚酶活性,能將酪氨酸羥化,產(chǎn)生鄰位二羥基苯丙氨酸(L-多巴),然后將多巴氧化成多巴醌,最終生成黑色素,使昆蟲初生的柔軟、色淡的新表皮得以黑化和硬化[5,7-8]。本研究認(rèn)為,在這一過程中,多巴脫羧酶的活性起著至關(guān)重要的作用,加之Retnakaran的報(bào)道,這就很好地解釋了蟲酰肼為什么可以抑制表皮酚氧化酶的活性。

處理種群在飼喂帶毒飼料后24、48 h和72 h,表皮酚氧化酶酶活抑制率分別為79.12%、10.54%和56.23%。酶活抑制率產(chǎn)生這種變化的原因可能是藥劑和昆蟲自身調(diào)節(jié)綜合作用的結(jié)果,當(dāng)殺蟲劑通過昆蟲取食進(jìn)入蟲體后,就會(huì)最大限度地發(fā)揮毒殺作用,抑制表皮酚氧化酶的活性;然而昆蟲可以通過自身的調(diào)節(jié)功能來抵抗這種作用,提高表皮酚氧化酶的活性,在兩者的相互作用達(dá)到平衡之前,酶活力的變化就會(huì)反復(fù),直到相互作用達(dá)到平衡時(shí),酶活力才會(huì)出現(xiàn)一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定值,后續(xù)結(jié)果有待進(jìn)一步測(cè)試。另外,表皮酚氧化酶的釋放高峰在昆蟲蛻皮時(shí),甜菜夜蛾幼蟲在28℃下平均48 h蛻皮一次,所以這也可能是在試蟲處理后48 h其酶活力與對(duì)照無明顯差異的原因之一。

本研究用混有蟲酰肼的帶毒飼料飼喂試蟲后,GST的比活力在飼喂后24 h與CK種群相比差異顯著,與N種群相比差異不顯著,而在飼喂后48 h和72 h GST的比活力與N種群存在顯著差異,與CK種群相比差異不顯著。說明蟲酰肼很可能可以促使甜菜夜蛾的GST酶活力提高,增強(qiáng)其解毒代謝的能力,導(dǎo)致甜菜夜蛾對(duì)蟲酰肼抵抗力增強(qiáng)。蘭亦全等報(bào)道甜菜夜蛾福州自然種群對(duì)蟲酰肼的抗性與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶有一定關(guān)系[9]與本研究相符。

本研究用混有蟲酰肼的帶毒飼料飼喂試蟲后,SOD酶的比活力在飼喂后24、48 h和 72 h均明顯高于CK種群,且差異顯著。表明蟲酰肼很可能可促使甜菜夜蛾SOD酶活力提高,增強(qiáng)其保護(hù)功能,提高甜菜夜蛾的抵抗能力。用混有蟲酰肼的帶毒飼料飼喂試蟲后,CAT酶的比活力在飼喂后48 h,與24 h和72 h相比差異顯著,處理種群與CK種群相比差異均不顯著。說明甜菜夜蛾對(duì)蟲酰肼的抗性與CAT的關(guān)系可能不大。

本研究用混有蟲酰肼的帶毒飼料處理試蟲后,乙酰膽堿酯酶的比活力與CK種群、N種群無差異存在。說明甜菜夜蛾對(duì)蟲酰肼的抗藥性與乙酰膽堿酯酶可能無關(guān)。酯酶同工酶電泳顯示,N種群、汰選種群(相對(duì)抗性種群)與CK種群均存在顯著差異,說明甜菜夜蛾對(duì)蟲酰肼的抗藥性與酯酶同工酶可能有很大的相關(guān)性。

以上各種酶在用蟲酰肼處理試蟲后不同時(shí)間酶活力的變化差異,同樣也可以用藥劑和昆蟲自身調(diào)節(jié)綜合作用的理論來解釋。

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