劉 楠, 王少麗, 宋福平, 束長(zhǎng)龍, 高繼國, 張 杰*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,哈爾濱 150030; 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193; 3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所,北京 100081)

小菜蛾[Plutella xylostella(Linnaeus)]是世界上對(duì)十字花科植物最具破壞性的害蟲,主要依賴化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治。但化學(xué)農(nóng)藥的濫用,已經(jīng)對(duì)人類健康和環(huán)境造成了巨大危害,同時(shí)引起了害蟲抗藥性產(chǎn)生的嚴(yán)重后果,使得田間用藥量進(jìn)一步增加,防治成本不斷加大,污染進(jìn)一步加重。生物防治是解決這些問題的有效途徑之一[1]。在過去的60年中,因?qū)Νh(huán)境和人畜安全、無殘留,蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,簡(jiǎn)稱Bt)在小菜蛾等重要農(nóng)業(yè)害蟲防治中扮演了重要的角色,已經(jīng)發(fā)展成為全球產(chǎn)量最大、應(yīng)用面積最廣的微生物殺蟲劑[2]。

Bt是一種革蘭氏陽性細(xì)菌,在芽胞形成的同時(shí),產(chǎn)生伴胞晶體,晶體中含有一種或多種δ-內(nèi)毒素蛋白(Cry殺蟲蛋白)。Bt殺蟲晶體蛋白對(duì)多種有害昆蟲,包括鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目,以及線蟲等原生動(dòng)物具有毒殺作用[3]。國內(nèi)外所應(yīng)用的Bt制劑絕大多數(shù)為B.thuringiensis subsp.kustaki亞種,其主要?dú)⑾x成分為Cry1A類蛋白。然而隨著Bt制劑在田間廣泛使用,小菜蛾已經(jīng)對(duì)Bt制劑產(chǎn)生了不同程度的抗性[4-6],因此如何合理有效地進(jìn)行這種抗性治理,已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中亟待解決的問題,關(guān)系到Bt這個(gè)重要生物防治資源能否可持續(xù)利用,更是實(shí)現(xiàn)蔬菜生產(chǎn)綠色、安全的重要保障。2006年,Zhao等報(bào)道了小菜蛾對(duì)轉(zhuǎn)單一Bt cry基因的花椰菜易產(chǎn)生抗性,而對(duì)轉(zhuǎn)雙價(jià)Bt cry基因植物很難產(chǎn)生抗藥性[7]。因此篩選和尋找與Cry1A類蛋白無交互抗性的新的Bt菌株和蛋白組合是克服和延緩害蟲抗藥性產(chǎn)生的有效途徑。

cry1Ba基因表達(dá)產(chǎn)物對(duì)鱗翅目和鞘翅目害蟲都具有殺蟲活性,已經(jīng)成功地用于工程菌構(gòu)建[8]和抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻研究[9]。cry1Ia類基因在Bt內(nèi)是一類沉默基因,其表達(dá)產(chǎn)物對(duì)多種農(nóng)業(yè)害蟲均有高毒力[10-11]。中國農(nóng)科院植物保護(hù)研究所先后克隆了cry1Ba3[8,12]和cry1Ia8基因[10],并發(fā)現(xiàn)兩者表達(dá)產(chǎn)物均對(duì)小菜蛾具有高毒力[10,13]。但是,迄今為止尚未見到Cry1B和Cry1I類蛋白對(duì)Bt抗性小菜蛾殺蟲活性的正式報(bào)道。

本文分別以Cry1Ba3、Cry1Ia8兩種單一的蛋白及其組合,分別對(duì)Cry1Ac抗性、敏感的小菜蛾種群進(jìn)行了生測(cè),結(jié)果表明這2種毒素,以及混合蛋白對(duì)Cry1Ac蛋白抗性小菜蛾具有高活性;這些結(jié)果為Cry1Ba3和Cry1Ia8對(duì)小菜蛾殺蟲作用機(jī)理的研究提供理論支持,為抗性治理和新一代轉(zhuǎn)基因抗蟲植物的研制提供了新的基因來源。

1 材料與方法

1.1 菌株及來源

所用菌株均為本組保藏,野生菌株UV17表達(dá)Cry1Ba3蛋白,標(biāo)準(zhǔn)菌株HD-73表達(dá)Cry1Ac蛋白;BL21-pB081Ia為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建含有cry1Ia8基因大腸桿菌表達(dá)型菌株[10],詳見表1。

表1 本研究所用的菌株及其表達(dá)的Cry類蛋白

1.2 供試小菜蛾

敏感種群、抗性種群為中國農(nóng)科院蔬菜與花卉所提供,其中抗性種群對(duì)Bt毒素Cry1Ac有顯著抗性,室內(nèi)持續(xù)用Cry1Ac蛋白汰選5年。

1.3 殺蟲晶體蛋白的制備

1.3.1 Bt菌株的培養(yǎng)與蛋白提取

采用等電點(diǎn)沉淀法提取[14]。30℃過夜活化HD-73(含有 cry1Ac基因)、UV-17菌株(含有cry1Ba3基因),以1%接種量轉(zhuǎn)接于1 L牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,30℃、230 r/min培養(yǎng)至芽胞形成。4℃、6 000 r/min離心,獲得胞晶混合物沉淀后,將沉淀重懸于 50 mL裂解液(50 mmol/L Na2CO3,50 mmol/L EDTA和5%的巰基乙醇,0℃預(yù)冷),在冰浴、100 r/min條件下溶解4 h;4℃、12 000 g離心收集上清,用 4.0 mol/L pH 4.5 NaAc-HAc緩沖液將 pH調(diào)至 4.5,以沉淀蛋白。4℃靜置4 h,4℃、12 000 g離心收集沉淀,用預(yù)冷的無菌水洗2遍,溶解于10 mL pH 9.6 50 mmol/L Na2CO3,備用。

1.3.2 大腸桿菌菌株的培養(yǎng)與蛋白提取

37℃過夜活化 BL21-pB081Ia菌株(含有cry1Ia8基因),以1%接種量轉(zhuǎn)接于200 mL LB液體培養(yǎng)基中,37℃,230 r/min培養(yǎng)2 h,加入誘導(dǎo)物IPTG,終濃度為0.5 mmol/L,150 r/min,20℃誘導(dǎo)10 h,離心、收集沉淀。將收集的沉淀加入1 mL的20 mmol/L T ris緩沖液(pH 8.0)懸浮,超聲破碎振幅37%,超聲1 min,裂解后,再離心收集上清,沉淀懸浮于1 mL 20 mmol/L Tris緩沖液[15]。

1.3.3 殺蟲晶體蛋白SDS-PAGE分析

將上述獲得的蛋白溶液 20 μ L,加入 20 μ L dd H2O,加入 20 μ L 3 倍 SDS-PAGE 上樣緩沖液 ,混勻,100℃5 min,12 000 g離心5 min,取上清為電泳樣品。SDS-PAGE分析條件：4%濃縮膠,8%分離膠,10 μ L上樣量,80 V 10 min,120 V 電泳,直到溴酚藍(lán)達(dá)到膠底部邊緣。上樣緩沖液與凝膠配制、染色脫色等參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行。電泳圖片用軟件Quantity One進(jìn)行定量分析。

1.4 生物活性測(cè)定

參照Tabashnik等的葉片浸漬法[17]。取新鮮、潔凈的甘藍(lán)葉片,用 0.1%Triton-100水溶液(50 mg/mL)稀釋 Bt毒素,以 0.1%Triton-100溶液處理作對(duì)照。將葉片在不同濃度的Bt毒素中浸10 s,放在平板上自然晾干,然后將葉片轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中,在培養(yǎng)皿底放一層浸過蒸餾水的濾紙保濕。每皿接入15頭2齡幼蟲,每個(gè)濃度重復(fù)4次,共處理60頭幼蟲。

Cry1Ba3和Cry1Ia8兩種蛋白按質(zhì)量比1∶1混配成組合蛋白溶液進(jìn)行生測(cè);Bt蛋白溶液以50 mmol/L Na2CO3為對(duì)照,大腸桿菌破碎沉淀以空載菌體破碎沉淀為對(duì)照,72 h調(diào)查結(jié)果。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用軟件Quantity One分析,選取已知濃度標(biāo)準(zhǔn)BSA為蛋白定量標(biāo)準(zhǔn),選取空白膠區(qū)域?yàn)?Background,選取目的條帶,并輸出分析報(bào)告。以分析結(jié)果的蛋白量進(jìn)行換算,計(jì)算出目的蛋白濃度進(jìn)行生物活性測(cè)定。殺蟲測(cè)定結(jié)果用POLO軟件處理,協(xié)同毒力指數(shù)采用 Tabashnik[18]公式法計(jì)算,公式如下：

協(xié)同毒力指數(shù)=試驗(yàn)所得LC50/預(yù)期LC50×100。

由于試驗(yàn)誤差和供試生物等未被覺察到的不一致性,一般認(rèn)為,預(yù)期LC50與實(shí)測(cè)LC50的毒力比值在50%～260%之間屬相加作用,大于260%屬增效作用,小于 50%時(shí)屬拮抗作用(Finney法)[19];用SAS軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 殺蟲蛋白SDS-PAGE分析

Cry1Ac、Cry1Ia8、Cry1Ba3 3 種蛋白分 別進(jìn)行SDS-PAGE定量分析,電泳結(jié)果參見圖1。Cry1Ia8、Cry1Ac、Cry1Ba3蛋白的分子量分別為 81、133、140 ku,濃度分別為 1.5、2.5、2.0 μ g/mL 。

圖1 3種Cry蛋白 SDS-PAGE定量分析

2.2 小菜蛾生物活性測(cè)定

2.2.1 小菜蛾抗性水平測(cè)定

首先對(duì)連續(xù)5年用Cry1Ac蛋白汰選的小菜蛾抗性種群進(jìn)行測(cè)定,以明確抗性倍數(shù)。測(cè)定結(jié)果：Cry1Ac蛋白對(duì)敏感小菜蛾 2齡幼蟲LC50為0.0466 μ g/mL(95%置信限 0.036 0～ 0.060 3 μ g/mL);而 Cry1Ac蛋白對(duì)抗性小菜蛾幼蟲 LC50=12.261 1 μ g/mL(95%置信限8.567 6～17.546 9 μ g/mL),抗性倍數(shù)約263倍。說明經(jīng)過Cry1Ac蛋白汰選,顯著降低了小菜蛾種群對(duì)Cry1Ac蛋白的敏感性。

2.2.2 供試樣品測(cè)定

Cry1Ia8、Cry1Ba3蛋白對(duì)敏感種群試蟲生測(cè)結(jié)果表明(詳見表 2)：Cry1Ba3 的 LC50=0.435 1 μ g/mL,Cry1Ia8 的 LC50=2.710 μ g/mL,Cry1Ba3 的毒力比Cry1Ia8高6.2倍。而Cry1Ia8+Cry1Ba3組合蛋白的LC50=0.526 6 μ g/mL,介于上述兩種蛋白之間。通過計(jì)算協(xié)同毒力指數(shù)(預(yù)期LC50=0.596 6 μ g/mL)(公式見 1.5)為88.267%,說明Cry1Ia8+Cry1Ba3組合蛋白對(duì)敏感種群沒有拮抗作用,也沒有明顯增效。

對(duì)抗性小菜蛾種群試蟲測(cè)定結(jié)果表明：Cry1Ba3 的 LC50=0.217 5 μ g/mL,Cry1Ia8 的LC50=0.670 6 μ g/mL,前者較后者毒力高約3倍;Cry1Ia8+Cry1Ba3 組合蛋白的 LC50=0.437 5 μ g/mL,介于Cry1Ia8、Cry1Ba3單一蛋白之間。通過計(jì)算協(xié)同毒力指數(shù)(LC50為 0.335 7 μ g/mL)(公式同前)為76.73%,說明Cry1Ia8+Cry1Ba3組合蛋白沒有拮抗作用,也沒有明顯增效。

用u測(cè)驗(yàn)分析同種樣品之間對(duì)抗性和敏感種群毒力差異的顯著性,用SAS軟件進(jìn)行計(jì)算(結(jié)果見表2),Cry1Ba3對(duì)于兩種群間的LC50差異不顯著(u=0.893,P=0.371 8),RI值為0.5;Cry1Ia8 LC50差異顯著(u=3.077,P=0.002 6),RI值為 0.2;而Cry1Ia8+Cry1Ba3組合蛋白 LC50差異不顯著(u=0.591,P=0.554 7),RI值為0.8。說明抗性品系對(duì)Cry1Ba3,Cry1Ia8+Cry1Ba3的敏感性沒有下降,而抗性品系對(duì)Cry1Ia8的敏感性反而有所上升。這些結(jié)果同時(shí)證明Cry1Ba、Cry1Ia8及其組合與Cry1Ac毒素不存在交互抗性。

表2 Bt毒素對(duì)小菜蛾不同種群的生物活性測(cè)定結(jié)果(72 h)

3 討論

本文通過對(duì)敏感和Cry1Ac抗性小菜蛾殺蟲活性研究,發(fā)現(xiàn)了Cry1Ba3、Cry1Ia8蛋白及其組合對(duì)這兩個(gè)種群均有高毒力,Cry1Ba3蛋白的毒力略高于Cry1Ia8蛋白。說明 Cry1Ba3、Cry1Ia8蛋白與Cry1Ac蛋白無交互抗性。Cry1Ba3、Cry1Ia8+Cry1Ba3組合對(duì)抗性和敏感種群的LC50數(shù)值差異不顯著;而Cry1Ia8對(duì)2個(gè)種群的LC50數(shù)值差異顯著,特別是對(duì)抗性害蟲的毒力高于敏感種群。這種原因值得進(jìn)一步深入研究。Cry1Ba對(duì)小菜蛾等鱗翅目害蟲[8]、葉甲科鞘翅目害蟲[12]具有活性,而Cry1Ia則對(duì)小菜蛾、玉米螟[Ostrinia f urnacalis(Guenée)]、棉 鈴 蟲 [Helicoverpaarmigera(Hübner)]等害蟲具有高毒力[10-11],作者研究發(fā)現(xiàn)兩者的組合雖然沒有顯著的協(xié)同增效作用,但是不存在拮抗,這種組合將有望擴(kuò)大殺蟲譜,并有效地克服或延緩害蟲抗性的產(chǎn)生[7]。

Cry1Ba3原毒素與Cry1Ac原毒素的相似性為57%,而與決定毒素的專一性和與受體的特異性結(jié)合的Domain II[20-21],相似性僅為28%。Cry1Ia8原毒素與Cry1Ac原毒素的相似性為45%,而與決定毒素的專一性和與受體的特異性結(jié)合的Domain II,相似性低于30%(序列數(shù)據(jù)來源http：∥www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil-Crickmore/Bt/toxins2.html,比對(duì)數(shù)據(jù)來自http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi),這說明可能是由于Cry1Ba3和Cry1Ia8與Cry1Ac的同源性比較低,在小菜蛾的中腸上的結(jié)合位點(diǎn)不同,因此與Cry1Ac蛋白沒有交互抗性。

Cry1Ba3和Cry1Ia8蛋白組合對(duì)小菜蛾沒有協(xié)同增效作用,經(jīng)比對(duì),兩者的Domain II相似性為62%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于兩者與Cry1Ac的相似性,推測(cè)這兩種蛋白在小菜蛾有可能存在相同或相似的殺蟲機(jī)制。關(guān)于兩者相互作用,還有待進(jìn)一步的試驗(yàn)結(jié)果來驗(yàn)證。

小菜蛾防治中的主要問題之一就是害蟲抗藥性,特別是對(duì)Bt制劑等微生物農(nóng)藥的抗性產(chǎn)生。作者從本實(shí)驗(yàn)室中克隆的cry類基因中篩選獲得了對(duì)抗性小菜蛾幼蟲有高毒力的Cry1Ba3和Cry1Ia8蛋白組合,為兩種蛋白殺蟲機(jī)理的研究提供理論支持,為延緩和克服害蟲抗性產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的研制提供了基因資源。目前,cry1Ba3和cry1Ia8基因組合正在用于轉(zhuǎn)基因抗蟲甘藍(lán)的研究,隨著轉(zhuǎn)cry1Ba3和cry1Ia8雙價(jià)基因甘藍(lán)的獲得,將為小菜蛾的抗性預(yù)防和治理提供強(qiáng)有力的支持。

[1]趙建周,吳世昌,顧言真,等.小菜蛾抗藥性治理對(duì)策研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),1996,29(1)：8-14.

[2]中國植物保護(hù)學(xué)會(huì).植物保護(hù)學(xué)學(xué)科發(fā)展報(bào)告,2007-2008[R].中國科學(xué)技術(shù)出版社,2008：138-142.

[3]Schnepf E,Crickmore N,Van Rie J,et al.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins[J].Microbiology and M olecular Biology Reviews,1998,62(3)：775-806.

[4]Tabashnik B E.Evolution of resistance to Bacillusthuringiensis[J].Annual Review of Entomology,1994,39：47-79.

[5]Wright D J,Iqbal M,Granero F,et al.A change in a single midgut receptor in the diamondback moth(Plutella xy lostella)is only in part responsible for field resistance to Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki and B.thuringiensis subsp.aizawai[J].Applied and Environmental Microbiology,1997,63(5)：1814-1819.

[6]Liu Y B,Tabashnik B E,M asson L,et al.Binding and toxicity of Bacillus thuringiensis protein Cry1C to susceptible and resistant diamondback moth(Lepidoptera：Plutellidae)[J].Journal of Economic Entomology,2000,93(1)：1-6.

[7]Zhao J,Cao J,Collins H L,et al.Concurrent use of transgenic plants expressing a single and two Bacillus thuringiensis genes speeds insect adaptation to pyramided plants[J].P roceedings of the National Academy of Sciences of the USA,2006,102(24)：8426-8430.

[8]Wang G,Zhang J,Song F,et al.Recombinant Bacillus thuringiensis strain shows high insecticidal activity against Plutella xylostella and Leptinotarsa decemlineata without affecting nontarget species in the field[J].Journal of Applied Microbiology,2008,105(5)：1536-1543.

[9]Victòria M,Enric M,Jean M V,et al.Inv itro insect-feeding bioassay to determine the resistance of transgenic rice plants transformed with insect resistance genes against striped stem borer(Chilo suppressalis)[J].In Vitro Cellular&Developmental Biology-Plant,2002,38(4)：310-315.

[10]竇黎明,韓嵐嵐,張杰,等.蘇云金芽胞桿菌cry1Ia基因的克隆、表達(dá)與活性研究[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2007,15(6)：1053-105.

[11]Slim T,Ammar E A,Mark B,et al.Evidence of oral toxicity of Photorhabdus temperata strain K122 against Pray s oleae and its improvement by heterologous expression of Bacillus thuringiensis cry 1Aa and cry1Ia genes[J].Journal of Invertebrate Pathology,2006,91(2)：131-135.

[12]張杰.對(duì)鞘翅目害蟲高毒力的Bt cry基因分離克隆和工程菌的構(gòu)建[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2000.

[13]王廣君,張杰,孫東輝,等.蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白Cry1Ba結(jié)構(gòu)域Ⅱ中 Loops結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究[J].生物工程學(xué)報(bào),2008,24(9)：1631-1636.

[14]Luo K,Banks D,Adang M J.T oxicity,binding,and permeability analy ses of four Bacillus thuringiensis Cry1 delta-endotoxins using brush border membrane vesicles of Spodoptera ex igua and S podoptera frugiperda[J].Applied and Environmental Microbiology,1999,65(2)：457-464.

[15]Song F,Zhang J,Gu A,et al.Identification of cry 1I-type genes from Bacillus thuringiensis strains and characterization of a novel cry1I-type gene[J].Applied and Environmental Microbiology,2003,69(9)：5207-5211.

[16]Maniatis T,Fritsch E F,Sambrook J.Molecular cloning：A laboratory manual[M].2nd ed New York：Cold Spring Harbor Laborato ry Press,1989：880-887.

[17]T abashnik B E,Cushing N L,Johnson M W.Diamondback moth resistance to insecticides in Hawaii：intra-island variation and cross-resistance[J].Journal of Economic Entomo1ogy,1987,80(6)：1091-1099.

[18]Tabashnik B E,Evaluation of synergism among Bacillus thuringiensis toxins[J].Applied and Environmental Microbiology,1992,58(10)：3343-3346.

[19]曹坳程,張向才.關(guān)于農(nóng)藥混用評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的討論[J].農(nóng)藥科學(xué)與管理,1999,20(4)：31-33.

[20]Li J,Carrol J,Ellar D J.Crystal structure of insecticidal δendotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5? resolution[J].Nature,1991,353(6347)：815-821.

[21]Boonserm P,Davis P,Ellar D J,et al.Crystal structure of the mosquito-larvicidal toxin Cry4Ba and its biological implications[J].Journal of Molecular Biology,2005,348(2)：363-382.