張瑞莉，劉 娣，梁 堯，張 婧，華育平

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后工作站/東北林業(yè)大學(xué)博士后流動站 黑龍江 哈爾濱150086；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院黑龍江哈爾濱 150030）

新城疫（Newcastle disease,ND），又稱為亞洲雞瘟，是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的一種高度接觸性傳染病，本病自1926年首次發(fā)生以來，已成為流行廣、死亡率高、經(jīng)濟損失重大、危害最嚴(yán)重的禽病之一。盡管對該病在診斷與防制方面進(jìn)行了大量的研究，并取得了較大的成就，但目前其仍是危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展最嚴(yán)重的疫病之一，尚無有效的治療方法[1-5]。因此，研制高效、低毒、無殘留的抗NDV藥物是防治本病的一個重要措施。

中藥作為天然產(chǎn)物，不但具有抑菌、殺菌和抗病毒作用，而且能夠調(diào)節(jié)、促進(jìn)機體的免疫功能，同時殘毒較低或無殘毒，副作用小，不易產(chǎn)生耐藥性，應(yīng)用于防治畜禽傳染病，前景極為廣闊。魚腥草是一種應(yīng)用廣泛的中藥，其揮發(fā)性成分對多種病毒都有抑制作用[6]。本試驗對魚腥草在雞胚內(nèi)的抗新城疫病毒活性進(jìn)行試驗研究，為臨床進(jìn)一步研究開發(fā)防治新城疫中藥提供科學(xué)的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 雞胚

10日齡雞胚，購自哈爾濱市紅星孵化場。

1.1.2 病毒 雞新城疫病毒（Mukteswar1系），由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供，經(jīng)SPF雞胚增殖，血凝效價28。

1.1.3 魚腥草（Houttuynia cordate Thunb.）購于哈爾濱藥材市場。

1.2 方法

1.2.1 NDV對雞胚半數(shù)感染量（EID50）測定

將病毒液依次作10倍稀釋，接種于10日齡雞胚尿囊腔內(nèi)，每個稀釋度接種0.2ml/枚，作四個重復(fù)，同時設(shè)正常雞胚對照。置37℃恒溫箱內(nèi)孵化48h，棄去24h內(nèi)死亡胚，收獲24h后死亡胚及48h活胚的尿囊液，進(jìn)行HA價的測定[7]。

1.2.2 魚腥草提取液的制備

稱取50g魚腥草，用500ml水浸泡24h，用武火燒開后文火煎煮30min，用紗布過濾；濾渣加水武火燒開后用文火煮30min，用紗布過濾。將兩次濾液合并文火濃縮至50ml。濃縮液先用1500r/min離心10min，棄去沉淀上清液加入3%醋酸殼聚糖溶液，邊加邊攪拌，100r/min，然后將藥液50℃水浴12h，離心取上清液。最后用生理鹽水定容到50ml，配成1：1的中藥溶液。

1.2.3 藥物對雞胚安全濃度試驗

將魚腥草提取液依次作2倍稀釋，接種于10日齡雞胚尿囊腔內(nèi)，每個稀釋度接種0.2ml/枚，作4個重復(fù)，同時設(shè)生理鹽水對照。置37℃恒溫箱內(nèi)孵化，棄去24h內(nèi)死亡胚，活胚繼續(xù)孵化直至出雛。

1.2.4 魚腥草在雞胚內(nèi)抗NDV活性試驗

將魚腥草中草藥提取液用無菌生理鹽水配制成含生藥1g/ml的藥液，然后依次做2倍稀釋（即1：2、1：4、1：8倍的稀釋）滅菌后進(jìn)行如下試驗：

第一種加藥方式：不同稀釋度魚腥草提取液與等量100EID50病毒液混合后，將混合液接種于10日齡雞胚，每個稀釋度5枚，0.2ml/胚，37℃恒溫培養(yǎng)48h，測定雞胚尿囊液的血凝效價。

第二種加藥方式：將不同稀釋度魚腥草提取液接種于10日齡雞胚，每個稀釋度5枚，0.2ml/枚，37℃恒溫培養(yǎng)2h，然后接種100EID50病毒液0.2ml/，37℃恒溫培養(yǎng)48h，測定雞胚尿囊液的血凝效價。

第三種加藥方式：先將100EID50病毒液液接種于5枚10日齡雞胚，37℃恒溫培養(yǎng)2h，再將不同稀釋度魚腥草提取液接種各胚，每個稀釋度5枚，0.2ml/枚，37℃恒溫培養(yǎng)48h，測定雞胚尿囊液的血凝效價。

以上試驗同時設(shè)立病毒及生理鹽水對照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Minitab軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，分析各組差異。

2 結(jié)果

2.1 NDV對雞胚半數(shù)感染量（EID50）測定結(jié)果

記錄不同稀釋度的病毒液HA試驗陽性數(shù)和陰性數(shù)，按照Reed-Muench方法，計算NDV毒株的EID50為10-4.375/0.2ml。

2.2 魚腥草對雞胚安全濃度試驗結(jié)果

注射不同稀釋濃度魚腥草提取液的雞胚均正常孵化成雛，說明魚腥草對雞胚無毒性。

2.3 魚腥草抗NDV活性試驗的結(jié)果

2.3.1 NDV和魚腥草同時注入雞胚試驗結(jié)果

表2-1 NDV和魚腥草同時注入雞胚血凝效價的測定結(jié)果

NDV和魚腥草同時注入雞胚時，魚腥草原液血凝效價較病毒對照組血凝效價差異極顯著（p＜0.01）；魚腥草21倍稀釋液血凝效價較病毒對照組血凝效價差異顯著（p＜0.05）；魚腥草22倍稀釋液和23倍稀釋液血凝效價較病毒對照組血凝效價差異不顯著（p＞0.05）。

2.32 魚腥草NDV接種后注入雞胚試驗結(jié)果

表2-2 魚腥草于NDV接種后注入雞胚血凝效價的測定結(jié)果

魚腥草于NDV接種后注入雞胚時，魚腥草21倍稀釋液血凝效價較病毒對照組血凝效價差異極顯著（p＜0.01）；魚腥草原液和22倍稀釋液血凝效價較病毒對照組血凝效價差異顯著（p＜0.05）；魚腥草23倍稀釋液血凝效價較病毒對照組血凝效價差異不顯著（p＞0.05）。

2.33 魚腥草先于NDV注入雞胚試驗結(jié)果

表2-3 魚腥草先于NDV注入雞胚血凝效價的測定結(jié)果

魚腥草先于NDV注入雞胚時，魚腥草22倍稀釋液和23倍稀釋液血凝效價較病毒對照組血凝效價差異極顯著（p＜0.01）；魚腥草21倍稀釋液血凝效價較病毒對照組血凝效價差異顯著（p＜0.05）；魚腥草原液血凝效價較病毒對照組血凝效價差異不顯著（p＞0.05）。

4 討論

新城疫病毒可在雞胚中增殖，并釋放到尿囊液中。新城疫病毒在一定條件下能使雞紅細(xì)胞發(fā)生肉眼可見的血凝現(xiàn)象。如在雞胚內(nèi)注入藥物后，尿囊液不出現(xiàn)血凝現(xiàn)象，則表示藥物在雞胚內(nèi)對新城疫病毒具有明顯抑制作用[8]。魚腥草為三白科植物蕺菜的全草，具有清熱解毒、消腫排膿、利尿通淋的功效，對多種細(xì)菌、病毒具有較強的抑制作用。研究顯示，魚腥草具有抑制流感病毒活性作用，魚腥草抗流感病毒作用的有效成分為其揮發(fā)油，作用機制是通過干擾病毒包膜而殺滅流感病毒[9]。本試驗結(jié)果顯示，魚腥草提取液和NDV同時加入、先加入魚腥草提取液后接種NDV及先接種NDV后加入魚腥草提取液的雞胚都現(xiàn)出了血凝減輕的現(xiàn)象，這可能是魚腥草揮發(fā)性成分發(fā)揮了抗病毒作用，抑制了NDV在雞胚內(nèi)的增殖。

本試驗中，病毒和中藥同時加入雞胚的目的是觀察藥物對病毒的直接抑制作用；先接種病毒后加中藥目的是觀察藥物能否對已進(jìn)入雞胚內(nèi)的病毒起作用，抑制其生物合成及成熟釋放；先加中藥后接種病毒目的是觀察藥物能否與侵入。結(jié)果顯示，三種不同加藥方式的雞胚尿囊液都出現(xiàn)了血凝減輕的現(xiàn)象，表明魚腥草提取液在雞胚內(nèi)既能直接抑制NDV增殖，又能阻止NDV的吸附，同時也能抑制NDV的生物合成及成熟釋放。

本試驗中，病毒和中藥同時加入雞胚時，藥液的濃度越高抗病毒活性越好；先接種病毒后加中藥時，21倍稀釋和22倍稀釋的藥液抗病毒活性更好；先加中藥后接種病毒時，抗病毒活性由弱到強依次為原液、21倍稀釋、22倍稀釋、23倍稀釋。結(jié)果表明，魚腥草提取液在雞胚內(nèi)抗新城疫病毒活性與其加藥方式及深度有關(guān)。

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