大腸桿菌氨基?；腹こ叹墓潭ɑ芯?/h1>
2010-06-05 02:43:32胡家俊,劉志剛,劉英等
化學(xué)與生物工程 2010年10期
大腸桿菌氨基?；?ACY1)工程菌能特異性催化水解N-乙酰-L-氨基酸，主要用于氨基酸的手性拆分。ACY1廣泛存在于動(dòng)物肝腎組織中和一些微生物體內(nèi)，這與其生理功能密切相關(guān)。目前，普遍認(rèn)為ACY1在生物體內(nèi)執(zhí)行蛋白質(zhì)代謝后的氨基酸挽救功能。
工業(yè)上用于氨基酸拆分的ACY1主要來(lái)源于豬腎和黑曲霉，其中豬腎ACY1酶活力較高，但需要從豬腎組織中提取，其來(lái)源有限、成本較高。為了擴(kuò)大豬腎ACY1的酶源，作者運(yùn)用分子生物學(xué)的方法成功構(gòu)建了大腸桿菌工程菌，能高效表達(dá)活力和天然酶相當(dāng)?shù)闹亟M豬腎ACY1。在此對(duì)該工程菌進(jìn)行了固定化研究，為重組豬腎ACY1在氨基酸生產(chǎn)工業(yè)中的大規(guī)模應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
1 實(shí)驗(yàn)
1.1 菌種與培養(yǎng)基
大腸桿菌氨基?；腹こ叹鶵OSETTA (DE3)/ pET28a-pacy1，自行構(gòu)建并保存。
LB培養(yǎng)基( g·L-1)：酵母粉5,蛋白胨 10,氯化鈉 10，pH值7.0。
1.2 試劑與儀器
氯化鈉、硼酸、無(wú)水氯化鈣、醋酸、醋酸鈉、N-乙酰-L-蛋氨酸、茚三酮、正丁醇、冰乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、葡萄糖、尿素、95%乙醇、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·5H2O，分析純；聚乙烯醇(PVA)、海藻酸鈉(SA)、瓊脂，化學(xué)純。
2HWY-2112B型恒溫振蕩器；TGL-16C型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；320-S型pH計(jì)； U-3000型分光光度計(jì)，日本 Hitachi公司；HL-2S型蠕動(dòng)泵，上海滬西分析儀器廠有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌懸液的制備
接種重組菌ROSETTA (DE3)/pET28a-pacy1的單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中，于37℃、250 r·min-1振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日將過(guò)夜培養(yǎng)物繼續(xù)于37℃、300 r·min-1振蕩培養(yǎng)至OD600=0.8，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0.2 mmol·L-1,繼續(xù)培養(yǎng)3 h，離心收集菌體，并用0.1 mol·L-1磷酸緩沖溶液 (pH值7.0)清洗。于3000 r·min-1、4℃離心3次，洗滌，重懸,制得一定濃度菌懸液，立即使用。
1.3.2 固定化細(xì)胞的制備
1.3.2.1 PVA固定化細(xì)胞的制備[1]
取9 g PVA加入90 mL水，加熱至沸騰并不斷攪拌至充分溶解，冷卻至室溫，加水定容至100 mL，滅菌，冷卻至40℃，按1∶10的菌膠比將一定濃度的菌懸液加入到PVA溶液中，充分混勻。然后用蠕動(dòng)泵滴入5%硼酸(用低濃度氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.0)中，固定化24 h。用生理鹽水洗凈，備用。
1.3.2.2 SA固定化細(xì)胞的制備
取2 g SA加入100 mL水，在60℃恒溫水浴鍋中加熱溶解，冷卻至室溫，加水定容至 100 mL，滅菌，冷卻至40℃，按1∶10的菌膠比將一定濃度的菌懸液加入到SA溶液中，充分混勻。然后用蠕動(dòng)泵滴入2%氯化鈣溶液中，固定化24 h。用生理鹽水洗凈，備用。
1.3.2.3 PVA-SA固定化細(xì)胞的制備
取11 g PVA和1 g SA，加入100 mL蒸餾水，水浴加熱至溶解并混勻,滅菌，冷卻至40℃，與15 mL菌懸液混合。然后用蠕動(dòng)泵滴入飽和硼酸-2%氯化鈣溶液中，固定化24 h。用生理鹽水洗凈，備用。改變PVA、SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)及固定劑用量進(jìn)行固定化。
1.3.3 固定化細(xì)胞顆粒機(jī)械強(qiáng)度及粒徑測(cè)定
1.3.3.1 機(jī)械強(qiáng)度測(cè)定[2]
機(jī)械強(qiáng)度以球徑變化率(X)表征，變化率高則機(jī)械強(qiáng)度低。取粒徑相當(dāng)?shù)亩鄠€(gè)固定化凝膠顆粒，用干凈濾紙吸去表面的水，均勻置于兩片平面玻片之間，用游標(biāo)卡尺測(cè)玻璃片間距r0，再將50 g的砝碼均勻放置在玻璃片上，用游標(biāo)卡尺測(cè)變化后的玻璃片間距r。球徑變化率X=[(r0-r)/r0]×100%。
1.3.3.2 固定化顆粒體積和平均直徑的測(cè)定
取經(jīng)充分浸潤(rùn)的固定化凝膠顆粒，用濾紙吸干其表面附著水分，先在量筒內(nèi)加入一定體積蒸餾水V1，再加入顆粒，此時(shí)，總體積為V2。所測(cè)的顆粒體積V=V2-V1。
取20粒固定化凝膠顆粒排列成直線，測(cè)其總長(zhǎng)度，計(jì)算固定化凝膠顆粒的平均直徑[3]。
1.3.4 酶活力的測(cè)定
ACY1酶活測(cè)定采用酸式茚三酮法[4]。(1)吸取2 mL 0.04 mol·L-1N-乙酰-L-蛋氨酸溶液(pH值7.0)加入到試管中，加入0.2 mol·L-1磷酸鉀緩沖溶液(pH值7.0)2 mL，于37℃恒溫水浴中保溫至平衡。(2)在試管中加入1 mL酶液，搖勻，每隔3 min吸取0.5 mL反應(yīng)液加入已有0.5 mL 0.5%三氯乙酸的試管中，立即搖勻終止反應(yīng)。(3)各試管中分別加入1 mL醋酸緩沖溶液(pH值5.4)和1 mL 0.5%茚三酮溶液，搖勻后放入90～100℃熱水中，反應(yīng)15 min，用自來(lái)水冷卻約5 min至室溫。(4)每管加入3 mL 60%乙醇，稀釋搖勻，測(cè)定OD570值。(5)利用已知濃度的Met溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可知反應(yīng)液中產(chǎn)物的濃度，從而計(jì)算相應(yīng)時(shí)間段的酶反應(yīng)速度。
酶活力定義：在25℃，每分鐘水解1 μmol·L-1N-乙酰-L-蛋氨酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
2 結(jié)果與討論
2.1 固定化載體的選擇
采用不同的固定化載體固定ACY1工程菌，結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 不同固定化載體的固定化效果
由表1可知,9%PVA 固定化細(xì)胞顆粒彈性好，但是平均變化率最高，即機(jī)械強(qiáng)度最低，且其成球性差，顆粒粒徑過(guò)大;2%SA及1%PVA-3%SA固定化顆粒的粒徑大小適中，成球性好，但是彈性不好，其中2%SA固定化顆粒的機(jī)械強(qiáng)度也低、1%PVA-3%SA固定化顆粒的機(jī)械強(qiáng)度大幅提高；10%PVA-1%SA固定化顆粒的平均變化率為3.07%，其機(jī)械強(qiáng)度明顯高于其它三種，彈性也好，受壓后易于恢復(fù)，粒徑大小也適中，但其成球性不是很好(出現(xiàn)拖尾)，這可以通過(guò)改變PVA比例來(lái)改善。綜合考慮，選擇PVA-1%SA復(fù)合載體來(lái)制備固定化顆粒。PVA所占比例較高，可提高彈性，有利于提高機(jī)械強(qiáng)度；適當(dāng)加入少量的SA可使成球性變好，粘連降低，小球機(jī)械強(qiáng)度和活性提高;粒徑越小，固定化收率和酶活越高，這是因?yàn)檩^小的顆粒具有良好的擴(kuò)散性。
2.2 PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)PVA-1%SA復(fù)合載體固定化效果的影響[5](表2)
表2 PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)PVA-1%SA復(fù)合載體固定化效果的影響
由表2可知，PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%時(shí)復(fù)合載體的固定化效果最好，因此，選擇8%PVA-1%SA為適宜的固定化材料(分別采用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PVA溶液及1%SA作載體，包埋相同濃度的菌懸液時(shí)，當(dāng)PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于8%時(shí)，固定化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度較差，不易成球，在使用過(guò)程中容易潰破，所以這里不予考慮)。
2.3 固定劑用量及pH值的選擇
改變固定劑用量及pH值制備固定化顆粒，結(jié)果見(jiàn)表 3。
表3 固定劑用量及pH值對(duì)固定化效果的影響
由表3可知，適宜固定劑為pH值6.7的3%硼酸-1%氯化鈣。
2.4 固定化細(xì)胞與游離細(xì)胞酶活力的比較
將相同菌比的固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞按1.3.4方法測(cè)定其OD570(本實(shí)驗(yàn)以O(shè)D570值表征酶活力大小，其值越高，L-半胱氨酸含量越高，則單位時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物量越高即酶活力越高)。不同保存條件下固定化細(xì)胞與游離細(xì)胞的OD570測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。
據(jù)表4中的OD570平均值繪制曲線，以直觀比較固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞的酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖1。
圖1 保存時(shí)間對(duì)固定化細(xì)胞與游離細(xì)胞酶活力的影響
由圖1可知，當(dāng)固定化細(xì)胞剛制備出來(lái)時(shí)，酶回收率(固定化細(xì)胞酶活與游離細(xì)胞酶活之比)高達(dá)91.46%；4℃下保存7 d后，固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞的酶活力均有所下降，但是下降幅度不大，分別為5.37%和13.50%；再室溫保存7 d后，固定化細(xì)胞的酶活力下降2.50%，而游離細(xì)胞的酶活力大幅下降(降幅51.3%)；再室溫保存14 d后，固定化細(xì)胞酶活力仍然僅小幅下降，為初始對(duì)照的90.76%，而游離細(xì)胞的酶活力大幅下降，只有初始對(duì)照的29.69%。由此可知，固定化細(xì)胞的酶活保留率明顯高于游離細(xì)胞，這是因?yàn)楣潭ɑd體對(duì)酶有保護(hù)作用[6]。
表4 不同保存條件下固定化細(xì)胞與游離細(xì)胞的OD570測(cè)定結(jié)果
3 結(jié)論
分別以聚乙烯醇(PVA)、海藻酸鈉(SA)及PVA-SA為固定化載體對(duì)大腸桿菌氨基酰化酶工程菌進(jìn)行固定。結(jié)果表明，PVA-SA固定化凝膠顆粒具有較好的機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性。確定PVA-SA的最佳包埋條件如下：PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%，SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，固定劑為pH值6.7的3%硼酸-1%氯化鈣。此條件下制備的固定化細(xì)胞的酶回收率為91.46%。于4℃保存7 d、再室溫保存14 d后，固定化細(xì)胞的酶活力為初始對(duì)照的90.76%，而游離細(xì)胞只有初始對(duì)照的29.69%。
參考文獻(xiàn)：
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[2] 林海，許平,周虹.聚乙烯醇(PVA)微珠發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇能力的改進(jìn)研究[J].四川食品與發(fā)酵，2006，42(5)：26-31.
[3] Sano K，Yokozeki K,Tamura F，et al．Microbial conversion of DL-2-amino-delta 2-thiazoline-4-carboxylic acid to L-cysteine and L-cystine：Screening of microorganisms and identification of products[J]．Appl Environ Microbiol，1977，34(6)：806-810．
[4] 周昌平，懷麗華，白鋼,等.酶法轉(zhuǎn)化DL-ATC合成L-半胱氨酸的酶促反應(yīng)條件研究[J].生物技術(shù)通訊，2006,17(6):911-913.
[5] 王雪梅,于明銳,譚天偉.海藻酸鈉復(fù)合載體固定化細(xì)胞拆分D,L-泛解酸內(nèi)酯[J].北京化工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2006,33(3):28-32.
[6] 鄭迎迎,李大力.殼聚糖載體的制備及脲酶的固定化研究[J].生物技術(shù)，2005,15(2)：56-59.
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1 實(shí)驗(yàn)
1.1 菌種與培養(yǎng)基
大腸桿菌氨基?；腹こ叹鶵OSETTA (DE3)/ pET28a-pacy1，自行構(gòu)建并保存。
LB培養(yǎng)基( g·L-1)：酵母粉5,蛋白胨 10,氯化鈉 10，pH值7.0。
1.2 試劑與儀器
氯化鈉、硼酸、無(wú)水氯化鈣、醋酸、醋酸鈉、N-乙酰-L-蛋氨酸、茚三酮、正丁醇、冰乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、葡萄糖、尿素、95%乙醇、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·5H2O，分析純；聚乙烯醇(PVA)、海藻酸鈉(SA)、瓊脂，化學(xué)純。
2HWY-2112B型恒溫振蕩器；TGL-16C型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；320-S型pH計(jì)； U-3000型分光光度計(jì)，日本 Hitachi公司；HL-2S型蠕動(dòng)泵，上海滬西分析儀器廠有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌懸液的制備
接種重組菌ROSETTA (DE3)/pET28a-pacy1的單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中，于37℃、250 r·min-1振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日將過(guò)夜培養(yǎng)物繼續(xù)于37℃、300 r·min-1振蕩培養(yǎng)至OD600=0.8，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0.2 mmol·L-1,繼續(xù)培養(yǎng)3 h，離心收集菌體，并用0.1 mol·L-1磷酸緩沖溶液 (pH值7.0)清洗。于3000 r·min-1、4℃離心3次，洗滌，重懸,制得一定濃度菌懸液，立即使用。
1.3.2 固定化細(xì)胞的制備
1.3.2.1 PVA固定化細(xì)胞的制備[1]
取9 g PVA加入90 mL水，加熱至沸騰并不斷攪拌至充分溶解，冷卻至室溫，加水定容至100 mL，滅菌，冷卻至40℃，按1∶10的菌膠比將一定濃度的菌懸液加入到PVA溶液中，充分混勻。然后用蠕動(dòng)泵滴入5%硼酸(用低濃度氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.0)中，固定化24 h。用生理鹽水洗凈，備用。
1.3.2.2 SA固定化細(xì)胞的制備
取2 g SA加入100 mL水，在60℃恒溫水浴鍋中加熱溶解，冷卻至室溫，加水定容至 100 mL，滅菌，冷卻至40℃，按1∶10的菌膠比將一定濃度的菌懸液加入到SA溶液中，充分混勻。然后用蠕動(dòng)泵滴入2%氯化鈣溶液中，固定化24 h。用生理鹽水洗凈，備用。
1.3.2.3 PVA-SA固定化細(xì)胞的制備
取11 g PVA和1 g SA，加入100 mL蒸餾水，水浴加熱至溶解并混勻,滅菌，冷卻至40℃，與15 mL菌懸液混合。然后用蠕動(dòng)泵滴入飽和硼酸-2%氯化鈣溶液中，固定化24 h。用生理鹽水洗凈，備用。改變PVA、SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)及固定劑用量進(jìn)行固定化。
1.3.3 固定化細(xì)胞顆粒機(jī)械強(qiáng)度及粒徑測(cè)定
1.3.3.1 機(jī)械強(qiáng)度測(cè)定[2]
機(jī)械強(qiáng)度以球徑變化率(X)表征，變化率高則機(jī)械強(qiáng)度低。取粒徑相當(dāng)?shù)亩鄠€(gè)固定化凝膠顆粒，用干凈濾紙吸去表面的水，均勻置于兩片平面玻片之間，用游標(biāo)卡尺測(cè)玻璃片間距r0，再將50 g的砝碼均勻放置在玻璃片上，用游標(biāo)卡尺測(cè)變化后的玻璃片間距r。球徑變化率X=[(r0-r)/r0]×100%。
1.3.3.2 固定化顆粒體積和平均直徑的測(cè)定
取經(jīng)充分浸潤(rùn)的固定化凝膠顆粒，用濾紙吸干其表面附著水分，先在量筒內(nèi)加入一定體積蒸餾水V1，再加入顆粒，此時(shí)，總體積為V2。所測(cè)的顆粒體積V=V2-V1。
取20粒固定化凝膠顆粒排列成直線，測(cè)其總長(zhǎng)度，計(jì)算固定化凝膠顆粒的平均直徑[3]。
1.3.4 酶活力的測(cè)定
ACY1酶活測(cè)定采用酸式茚三酮法[4]。(1)吸取2 mL 0.04 mol·L-1N-乙酰-L-蛋氨酸溶液(pH值7.0)加入到試管中，加入0.2 mol·L-1磷酸鉀緩沖溶液(pH值7.0)2 mL，于37℃恒溫水浴中保溫至平衡。(2)在試管中加入1 mL酶液，搖勻，每隔3 min吸取0.5 mL反應(yīng)液加入已有0.5 mL 0.5%三氯乙酸的試管中，立即搖勻終止反應(yīng)。(3)各試管中分別加入1 mL醋酸緩沖溶液(pH值5.4)和1 mL 0.5%茚三酮溶液，搖勻后放入90～100℃熱水中，反應(yīng)15 min，用自來(lái)水冷卻約5 min至室溫。(4)每管加入3 mL 60%乙醇，稀釋搖勻，測(cè)定OD570值。(5)利用已知濃度的Met溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可知反應(yīng)液中產(chǎn)物的濃度，從而計(jì)算相應(yīng)時(shí)間段的酶反應(yīng)速度。
酶活力定義：在25℃，每分鐘水解1 μmol·L-1N-乙酰-L-蛋氨酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
2 結(jié)果與討論
2.1 固定化載體的選擇
采用不同的固定化載體固定ACY1工程菌，結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 不同固定化載體的固定化效果
由表1可知,9%PVA 固定化細(xì)胞顆粒彈性好，但是平均變化率最高，即機(jī)械強(qiáng)度最低，且其成球性差，顆粒粒徑過(guò)大;2%SA及1%PVA-3%SA固定化顆粒的粒徑大小適中，成球性好，但是彈性不好，其中2%SA固定化顆粒的機(jī)械強(qiáng)度也低、1%PVA-3%SA固定化顆粒的機(jī)械強(qiáng)度大幅提高；10%PVA-1%SA固定化顆粒的平均變化率為3.07%，其機(jī)械強(qiáng)度明顯高于其它三種，彈性也好，受壓后易于恢復(fù)，粒徑大小也適中，但其成球性不是很好(出現(xiàn)拖尾)，這可以通過(guò)改變PVA比例來(lái)改善。綜合考慮，選擇PVA-1%SA復(fù)合載體來(lái)制備固定化顆粒。PVA所占比例較高，可提高彈性，有利于提高機(jī)械強(qiáng)度；適當(dāng)加入少量的SA可使成球性變好，粘連降低，小球機(jī)械強(qiáng)度和活性提高;粒徑越小，固定化收率和酶活越高，這是因?yàn)檩^小的顆粒具有良好的擴(kuò)散性。
2.2 PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)PVA-1%SA復(fù)合載體固定化效果的影響[5](表2)
表2 PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)PVA-1%SA復(fù)合載體固定化效果的影響
由表2可知，PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%時(shí)復(fù)合載體的固定化效果最好，因此，選擇8%PVA-1%SA為適宜的固定化材料(分別采用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PVA溶液及1%SA作載體，包埋相同濃度的菌懸液時(shí)，當(dāng)PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于8%時(shí)，固定化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度較差，不易成球，在使用過(guò)程中容易潰破，所以這里不予考慮)。
2.3 固定劑用量及pH值的選擇
改變固定劑用量及pH值制備固定化顆粒，結(jié)果見(jiàn)表 3。
表3 固定劑用量及pH值對(duì)固定化效果的影響
由表3可知，適宜固定劑為pH值6.7的3%硼酸-1%氯化鈣。
2.4 固定化細(xì)胞與游離細(xì)胞酶活力的比較
將相同菌比的固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞按1.3.4方法測(cè)定其OD570(本實(shí)驗(yàn)以O(shè)D570值表征酶活力大小，其值越高，L-半胱氨酸含量越高，則單位時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物量越高即酶活力越高)。不同保存條件下固定化細(xì)胞與游離細(xì)胞的OD570測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。
據(jù)表4中的OD570平均值繪制曲線，以直觀比較固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞的酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖1。
圖1 保存時(shí)間對(duì)固定化細(xì)胞與游離細(xì)胞酶活力的影響
由圖1可知，當(dāng)固定化細(xì)胞剛制備出來(lái)時(shí)，酶回收率(固定化細(xì)胞酶活與游離細(xì)胞酶活之比)高達(dá)91.46%；4℃下保存7 d后，固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞的酶活力均有所下降，但是下降幅度不大，分別為5.37%和13.50%；再室溫保存7 d后，固定化細(xì)胞的酶活力下降2.50%，而游離細(xì)胞的酶活力大幅下降(降幅51.3%)；再室溫保存14 d后，固定化細(xì)胞酶活力仍然僅小幅下降，為初始對(duì)照的90.76%，而游離細(xì)胞的酶活力大幅下降，只有初始對(duì)照的29.69%。由此可知，固定化細(xì)胞的酶活保留率明顯高于游離細(xì)胞，這是因?yàn)楣潭ɑd體對(duì)酶有保護(hù)作用[6]。
表4 不同保存條件下固定化細(xì)胞與游離細(xì)胞的OD570測(cè)定結(jié)果
3 結(jié)論
分別以聚乙烯醇(PVA)、海藻酸鈉(SA)及PVA-SA為固定化載體對(duì)大腸桿菌氨基酰化酶工程菌進(jìn)行固定。結(jié)果表明，PVA-SA固定化凝膠顆粒具有較好的機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性。確定PVA-SA的最佳包埋條件如下：PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%，SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，固定劑為pH值6.7的3%硼酸-1%氯化鈣。此條件下制備的固定化細(xì)胞的酶回收率為91.46%。于4℃保存7 d、再室溫保存14 d后，固定化細(xì)胞的酶活力為初始對(duì)照的90.76%，而游離細(xì)胞只有初始對(duì)照的29.69%。
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