崔爽爽,杜利清,王月英,孟愛民,王小春*,趙永成*

(1北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,北京 100730；2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所)

放療是肺癌治療的主要手段,但不同個體對放療的敏感性存在差異。如果在治療前可預(yù)測患者對放療的敏感性,就可能擬訂對腫瘤有最高療效而對正常組織損傷最低的放療劑量,但目前尚無臨床預(yù)測放療敏感性的指標(biāo)。2008年 10月 ～2009年 8月,我們檢測了非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者癌組織中微型核糖核酸(miRNA)表達(dá)譜的變化,并探討其與 NSCLC放療敏感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 30例Ⅱ ～Ⅲ期 NSCLC患者中,男21例、女 9例,平均年齡 47歲；其中鱗癌 23例,腺癌 7例；患者術(shù)前未行任何治療,于 2001～2003年均行手術(shù)治療,并收集其癌組織標(biāo)本,術(shù)后均行放療(總累積劑量 60 Gy,60Co光子束,周劑量 10 Gy)。根據(jù)總體生存率和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移情況將患者分為兩組,生存率 ＞36個月、無遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移者為放療敏感組,其他為放療不敏感組,每組 15例。

1.2 癌組織中 miRNA表達(dá)譜檢測 采用 miRNA表達(dá)譜芯片檢測。操作步驟:①小 RNA提取:按 miRNeasy Mini Kit操作說明提取 C57BL/6J小鼠大腦組織的大 RNA(＞200 nt)和小 RNA(＜200 nt),通過測定 260 nm下的光密度值確定 RNA濃度,用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)大 RNA未降解,以保證小 RNA的質(zhì)量。用 3.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的 NuSieve瓊脂糖凝膠電泳檢測小 RNA。②miRNA微陣列基因分析:在 μParafloTM微流體芯片上含有最新版本探針序列(Version 10.0 RNA數(shù)據(jù)庫)及 LC Sciences公司提供的質(zhì)控探針,探針由(光敏試劑)PGR化學(xué)試劑原位合成。微陣列實(shí)驗(yàn)需要 2～5μg總 RNA樣品,通過 YM-100微離心過濾柱得到片段 ＜300 nt的小RNA。Poly(A)聚合酶在分離到的小 RNA 3'端加上poly(A)尾巴,再將一個寡聚核苷酸標(biāo)記與這個 poly(A)尾巴連接用于后續(xù)的熒光標(biāo)記。在雙樣品實(shí)驗(yàn)中,用 2個不同的標(biāo)記物來標(biāo)記 2個 RNA樣品。雜交反應(yīng)通過微循環(huán)泵雜交儀器在 μParafloTM微流體芯片上過夜[1]。雜交使用含 25%甲酰胺的 100μl 6×SSPE緩沖液,雜交溫度 34℃。雜交檢測使用 Cy3和Cy5特異性熒光標(biāo)記,激光掃描儀采集雜交圖像,用Array-Pro軟件對雜交圖像進(jìn)行數(shù)字化轉(zhuǎn)換。③微陣列數(shù)據(jù)分析:數(shù)據(jù)處理和分析首先是扣除背景,計算重復(fù)點(diǎn)平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差,再通過LOWESS過濾進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。對于雙色標(biāo)記實(shí)驗(yàn),將計算兩種檢測信號的比值(log2)和 t-test的 P值。P≤0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用 Cluster 3.0軟件對結(jié)果進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果

與放療不敏感組相比,放療敏感組中有 5個miRNA(miR-126、miR-let-7a、miR-495、miR-451、miR-128b)表達(dá)顯著上調(diào),7個 miRNA(miRNA-130a、miRNA-106b、miRNA-19b、 miRNA-22、miRNA-15b、miRNA-17-5p、miRNA-21)表達(dá)顯著下調(diào),詳見表1。

表1 兩組12個差異表達(dá)的miRNA比較

3 討論

miRNA是一類小的(19～24 nt)非編碼 RNAs,可負(fù)調(diào)控靶基因 mRNAs的穩(wěn)定性或轉(zhuǎn)錄效率,在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、發(fā)育、分化及代謝等方面發(fā)揮重要作用。目前,已在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)特異性 miRNA表達(dá)譜,包括慢性 B型淋巴細(xì)胞性白血病[2]、乳腺癌[3]、初級惡性膠質(zhì)瘤[4]、肝細(xì)胞癌[5]、乳頭狀甲狀腺癌[6]、肺癌[7]、胃癌和結(jié)腸癌等[8]。

研究發(fā)現(xiàn),miRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用,并與其預(yù)后有關(guān)。因此,我們檢測了放療敏感和不敏感 NSCLC患者癌組織中 miRNA表達(dá)譜的差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn),12個 miRNA的表達(dá)在放療敏感組和不敏感組有顯著差異。Brueckner等采用 Northern blotting法檢測了 16例肺癌患者癌組織中的 miRNA-let-7a,其中 7例 miRNA-let-7a表達(dá)與健康對照相比降低了80%；另有研究表明,miRNA-let-7a低表達(dá)者肺癌術(shù)后生存率較低[9]。本研究結(jié)果顯示,放療敏感組癌組織中 miRNA-let-7a表達(dá)較不敏感組高,提示 miRNA-let-7a可能與 NSCLC放療敏感性有關(guān)。miRNA-126在腫瘤細(xì)胞的增殖中發(fā)揮重要作用,尚未見其與放射敏感性關(guān)系的報道。本研究發(fā)現(xiàn),miRNA-126在兩組患者癌組織中變化最顯著,提示其與肺癌放療敏感性可能存在很大相關(guān)性。miRNA-21位于肺癌擴(kuò)增的位點(diǎn),miRNA-451、miRNA-106b可能在支氣管肺泡干細(xì)胞保持自我更新能力中發(fā)揮重要作用[10]。本研究發(fā)現(xiàn),miRNA-2、miRNA-451、miRNA-106b在放療敏感組癌組織中的表達(dá)低于不敏感組,提示三者可能與肺癌的放療敏感性有關(guān)。但影響放療敏感性的因素較多,尚需深入研究。

[1]Gao X,Gulari E,Zhou X.In situ synthesis of oligonucleotide microarrays[J].Biopolymers,2004,73(5):579-596.

[2]Calin GA,Liu CG,Sevignani C,et al.MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(32):11755-11760.

[3]Iorio MV,Ferracin M,Liu CG,et al.MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer[J].Cancer Res,2005,65(16):7065-7070.

[4]Ciafre SA,Galardi S,Mangiola A,et al.Extensive modulation of a set of microRNAs in primary glioblastoma[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,334(4):1351-1358.

[5]Murakami Y,Yasuda T,Saigo K,et al.Comprehensive analysis of microRNA expression patternsin hepatocellular carcinoma and nontumoroustissues[J].Oncogene,2006,25(17):2537-2545.

[6]Liu B,Peng XC,Zheng XL,et al.MiR-126 restoration down-regulate VEGF and inhibit the growth of lung cancer cell lines in vitro and in vivo[J].Lung Cancer,2009,66(2):169-175.

[7]Takamizawa J,Konishi H,Yanagisawa K,et al.Reduced expression of the let-7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival[J].Cancer Res,2004,64(11):3753-3756.

[8]Michael MZ,O′Connor SM,van Holst Pellekaan NG,et al.Reduced accumulation of specific microRNAs in colorectal neoplasia[J].Mol Cancer Res,2003,1(12):882-891.

[9]Fang WJ,Lin CZ,Zhang HH,et al.Detection of let-7a microRNA by real-time PCR in colorectal cancer:a single-centre experience from China[J].JInt Med Res,2007,35(5):716-723.

[10]Brueckner B,Stresemann C,Kuner R,et al.The human let-7a-3 locus contains an epigenetically regulated microRNA gene with oncogenic function[J].Cancer Res,2007,67(4):1419-1423.