韓忠敏,井長(zhǎng)勤

(1鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院,鄭州 450052；2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院)

白藜蘆醇(Res)屬非黃酮多酚類(lèi)物質(zhì),是一類(lèi)主要存在于葡萄、藜蘆、虎杖等植物中的多酚類(lèi)化合物,因首先在歐洲的白藜蘆中被提取而得名。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Res對(duì)腫瘤的起始、發(fā)展均有抑制作用[1]。新生血管生成是腫瘤細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的必備條件,血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (VEGF)是最重要的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)刺激因子。2008年 6月 ～2009年 1月,我們觀察了 Res對(duì)人食管癌細(xì)胞 Eca-109增殖的影響,并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 Eca-109,常規(guī)培養(yǎng)于含 10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基中,置 37℃、飽和濕度為 5%的CO2培養(yǎng)箱孵育,0.25%胰酶-EDTA消化傳代至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；Res(純度 99%),用二甲基亞砜(DMSO)溶解,母液濃度為 100 mmol/L,-20℃避光保存；DMEM培養(yǎng)基,總 RNA提取試劑盒,cDNA合成試劑盒及 PCR擴(kuò)增試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 Eca-109細(xì)胞增殖情況觀察 采用 MTT法。調(diào)整細(xì)胞濃度為 1.5×104/ml,取 200μl接種于 96孔板。24 h后觀察組加入終濃度為 10、20、40 μmol/L的 Res,對(duì)照組加入 DMSO,每組設(shè) 4個(gè)復(fù)孔。于培養(yǎng) 24、48、72 h,吸盡舊培養(yǎng)液,每孔加 20 μl MTT(5 g/L)繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。吸盡培養(yǎng)液,加入DMSO,振蕩至紫色結(jié)晶完全溶解。用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔 570 nm的吸光度 A值,計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(IR)。IR(%)=(實(shí)驗(yàn)組 A570-對(duì)照組 A570)/對(duì)照組 A570×100%。

1.2.2 Eca-109細(xì)胞 VEGF mRNA檢測(cè) 采用 RTPCR法。應(yīng)用 Primer 5.0軟件設(shè)計(jì) VEGF引物序列,由上海生工生物公司合成。以管家基因 GAPDH的 cDNA起始模板數(shù)對(duì) VEGF基因的起始模板進(jìn)行標(biāo)化,設(shè)定無(wú) cDNA樣品的空白管為陰性對(duì)照。采用 Trizol一步法提取總 RNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)樣品 A260和 A280值,瓊脂糖凝膠電泳鑒定 RNA質(zhì)量。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA,用以 PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳、EB染色。凝膠圖像分析系統(tǒng)以 VEGF與 GAPDH電泳帶的吸光度比值作為 VEGFmRNA表達(dá)量。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS12.0軟件分析。數(shù)據(jù)比較用 t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組 Eca-109細(xì)胞 IR比較 見(jiàn)表1。

表1 兩組 Eca-109細(xì)胞 IR比較(%,±s)

表1 兩組 Eca-109細(xì)胞 IR比較(%,±s)

注:與對(duì)照組比較,*P＜0.05,#P＜0.01

組別 IR 24 h 48 h 72 h觀察組10μmol/L 3.20±0.02* 6.71±0.02* 13.52±0.12*20μmol/L 23.32±2.13*43.21±3.87* 54.52±2.87*40μmol/L 46.72±3.89*65.08±5.70# 87.71±3.70#對(duì)照組 0 0 0

2.2 兩組 Eca-109細(xì)胞 VEGF mRNA表達(dá)比較見(jiàn)表2。

表2 兩組 Eca-109細(xì)胞 VEGF mRNA表達(dá)比較(±s)

表2 兩組 Eca-109細(xì)胞 VEGF mRNA表達(dá)比較(±s)

注:與對(duì)照組比較,*P＜0.01,#P＜0.05

組別 VEGF mRNA 24 h 48 h 72 h觀察組10μmol/L 1.102±0.054*1.010±0.052*0.875±0.254#20μmol/L 0.912±0.046*0.835±0.043*0.526±0.312#40μmol/L 0.212±0.032*0.156±0.025*0.107±0.209#對(duì)照組 1.814±0.062 1.711±0.059 1.426±0.326

3 討論

Res是許多植物在受到真菌感染、紫外線照射或病理狀況下產(chǎn)生的一種植物抗毒素,具有多種生物活性,因其對(duì)腫瘤的抑制作用而備受關(guān)注,被認(rèn)為是天然化學(xué)防癌劑之一。目前,對(duì) Res的抗癌機(jī)制尚不清楚,認(rèn)為其抗癌機(jī)制是多途徑的。Latruffe等[2]研究發(fā)現(xiàn),Res可以抑制肝癌細(xì)胞 HepG2及結(jié)腸癌 SW480細(xì)胞從 S期進(jìn)入 G2/M期,并呈劑量依賴(lài)關(guān)性。Park等[3]研究表明,Res能誘導(dǎo)人早幼粒白血病細(xì)胞向非增殖表型分化,提示其在腫瘤發(fā)展階段亦有明顯的抑制作用。喬振奎等[4]研究發(fā)現(xiàn),Res可通過(guò)抑制前列腺癌細(xì)胞株 PC-3中 VEGF-C的表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤活性。李永軍等[5]采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè) Res誘導(dǎo)食管癌 Eca-109細(xì)胞凋亡的作用,認(rèn)為與其增加細(xì)胞凋亡相關(guān)基因 survivin、Bax和 Bc1-2的表達(dá)有關(guān)。

VEGF是體內(nèi)外血管內(nèi)皮細(xì)胞最主要的有絲分裂原,通過(guò)選擇性地與血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上高親和力的受體酪氨酸激酶結(jié)合,使受體磷酸化而活化,然后進(jìn)一步激活其下游的相關(guān)基因表達(dá),刺激內(nèi)皮細(xì)胞遷移與增殖；同時(shí),VEGF也可增加血管內(nèi)皮的通透性,血液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞間隙,使腫瘤直接獲得營(yíng)養(yǎng)；此外,VEGF還能誘導(dǎo)某些抗凋亡因子如 Bcl-2、X1-AP等的表達(dá),抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。葉春祥等[6]研究發(fā)現(xiàn),VEGF在食管鱗狀上皮細(xì)胞中的異常表達(dá)與食管癌組織中淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),說(shuō)明 VEGF表達(dá)水平可作為食管癌患者預(yù)后判斷及轉(zhuǎn)移的參考指標(biāo)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),Res對(duì)食管癌細(xì)胞 Eca-109增殖具有抑制作用,且隨藥物濃度的增加,培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),抑制率升高,呈時(shí)間和劑量依賴(lài)關(guān)系；RT-PCR證實(shí),一定濃度的 Res對(duì) Eca-109中 VEGF mRNA的表達(dá)有抑制作用,提示 Res可能通過(guò)抑制食管癌細(xì)胞中 VEGF基因的表達(dá)而發(fā)揮抗腫瘤作用,為臨床 Res治療食管癌提供了理論依據(jù)。

[1]Kundu JK,Chun KS,Kim SO,et al.Resveratrol inhibitsphorbol ester-induced cyclooxygenase-2 expression in mouseskin:MAPKs and AP-1 as potential molecular targets[J].Biofactors,2004,21(1-4):33-39.

[2]Latruffe N,Delmas D,Jannin B,et al.Molecular analysiss on the chemopreventive properties of resveratro,a plantpolyphendmicrocomponent[J].Int JMol Med,2002,10(6):755-760.

[3]Park JW,Choi YJ,Jang MA,et al.Chemopreventive agent resveratrol,a natural product derived from grapes,reversibly inhibits progression through S and G2 phases of the cell cycle in U937 cells[J].Cancer Lett,2001,163(1):43-49.

[4]喬振奎,徐萬(wàn)海,王曉民,等.白藜蘆醇對(duì)人前列腺癌 PC-3細(xì)胞株 VEGF的表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響[J].實(shí)用腫瘤學(xué)雜志,2009,23(3):242-244.

[5]李永軍,孫曉慧,王崇.白藜蘆醇誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡及其相關(guān)基因表達(dá)的研究[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2009,24(3):196-200.

[6]葉春祥.VEGF-C在食管癌中的表達(dá)及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)性研究進(jìn)展[J].四川生理科學(xué)雜志,2009,31(1):35-36.