馬彥軍,曹致中,李 毅

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,甘肅蘭州 730070;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

尖葉胡枝子(Lespedeza hedysaroides)為草本狀半灌木,具有防風(fēng)固沙,抗寒、耐旱、耐貧瘠等特性,是較好的水土保持植物,又因其適口性好[1-3],粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量高,返青早、枯黃晚、綠期長等優(yōu)點(diǎn)[4],可作為改良干旱、半干旱退化草地和建植人工草地的優(yōu)良牧草,被廣泛應(yīng)用于我國草地生態(tài)建設(shè)和城鄉(xiāng)綠化美化中[5,6]。水分脅迫是植物生長發(fā)育過程中最易遭受到的生態(tài)脅迫因子[7],它對植物形態(tài)、光合作用、呼吸作用、物質(zhì)運(yùn)輸與合成等均會產(chǎn)生深刻的影響[8]。同時(shí),植物也會通過一些生理生化反應(yīng)來適應(yīng)水分脅迫生境,如適度干旱脅迫時(shí),植物體內(nèi)有關(guān)代謝酶活性升高,細(xì)胞膜系統(tǒng)的抗氧化能力增加,可以消除植物體內(nèi)的過氧化氫(H2O2)和超氧陰離子自由基(O2-)等活性氧對細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷,從而提高植物的抗逆性[9]。目前,對胡枝子屬植物的栽培及生態(tài)生物學(xué)的研究報(bào)道較多[10],而其抗旱性研究報(bào)道較少[11-13]。為此,以尖葉胡枝子幼苗為對象,研究PEG模擬干旱脅迫對其幼苗超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)同工酶、酶含量以及酶活性的影響,初步揭示其抗旱機(jī)理,了尖葉胡枝子抗旱性研究,合理開發(fā)利用及育種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為2006年在平?jīng)鲮`臺收集的尖葉胡枝子種子。

1.1.1 種子預(yù)處理 將供試種子用75%的酒精消毒1～2 min后,用無菌水沖洗干凈,在100℃水中浸泡5 min后,用自來水沖洗冷卻降溫,放置24 h后剔除未吸脹種子,備用。

1.1.2 PEG處理 將經(jīng)過預(yù)處理的種子置于120 mm培養(yǎng)皿內(nèi)浸透了不同濃度PEG(質(zhì)量濃度分別為50 g/L,100 g/L和150g/L)溶液的濾紙上發(fā)芽,每天向?yàn)V紙加PEG溶液數(shù)滴,以浸透濾紙并稍有剩余,每2 d換1次濾紙,以盡量減少水勢變動。對照(CK)以蒸餾水代替PEG。每個濃度梯度(包括對照)3次重復(fù),每個重復(fù)100粒種子。室溫下發(fā)芽,待苗高達(dá)到5 cm時(shí),取葉片進(jìn)行SOD和POD同工酶電泳。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 粗酶液的制備 分別稱取不同PEG濃度處理的尖葉胡枝子葉片0.5 g,加入2 mL 50 mmol/L pH 7.8的磷酸緩沖液(PBS內(nèi)含2 mmol/L EDTA-Na2,1%聚乙烯吡咯烷酮)冰浴研磨成勻漿,勻漿于13 000 rpm,4℃離心20 min,上清液即為粗酶提取液。

1.2.2 電泳 采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳。分離膠濃度7%(以丙烯酰胺濃度計(jì)),濃縮膠濃度為3%(以丙烯酰胺濃度計(jì)),點(diǎn)樣量20μ L,在 80～100 V 穩(wěn)壓條件下電泳3～4 h。

POD染色采用聯(lián)苯胺染色法。待酶帶顯出,立即放入自來水沖洗,酶帶全變成棕色,在GDS-8000凝膠成像系統(tǒng)上拍照;

SOD染色采用氮藍(lán)四唑(NBT)法。用4000×光照25～30 min SOD的活性譜帶表現(xiàn)為藍(lán)色背景上的無色透明區(qū)帶,在GDS-8000凝膠成像系統(tǒng)上拍照。

結(jié)果采用國際認(rèn)證的Pharmacia Biotech公司的電泳圖譜分析軟件ImageMaster 1D(Version 2.0)進(jìn)行譜帶分析。

SOD和POD活性單位采用GDS-8000凝膠成像系統(tǒng)掃描的灰度值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度PEG脅迫對尖葉胡枝子幼苗葉片SOD和POD同工酶的影響

結(jié)果顯示(表1),尖葉胡枝子幼苗葉片在不同濃度PEG脅迫,SOD和POD同工酶譜帶數(shù)目沒有變化,無新酶帶的出現(xiàn)或酶帶的減少,分別為酶帶SOD1-4和POD1-3。

表1 PEG脅迫尖葉胡枝子幼苗葉片S OD和POD同工酶遷移率Table 1 Mobility rate of S OD and POD isozyme in the seedling of Lespedeza hedysaroides

由表1可以看出,不同濃度PEG處理,尖葉胡枝子幼苗葉片4種SOD同工酶的遷移率大小不一。SOD1和SOD2在100 g/L和150 g/L PEG處理下遷移率一致,分別為0.04和0.44,在50 g/L PEG處理下分別為0.05和0.43,對照分別為0.03和 0.42;SOD3在50 g/L,100 g/L和150 g/L PEG處理下,遷移率一致為0.62,對照為0.61;SOD4在100 g/L和150 g/L PEG處理下遷移率一致,為0.94。在50 g/L PEG處理下和對照的遷移率一致,為0.93。在對照和50 g/L PEG處理下,各同工酶的遷移率不一致,而在100 g/L和150 g/L處理下,各SOD同工酶的遷移率一致。

不同濃度PEG處理,尖葉胡枝子幼苗葉片3種POD同工酶的遷移率大小不一。POD1在50 g/L,100 g/L和150 g/L PEG處理下遷移率均為0.01,對照為0.02;POD2在對照、50 g/L,100 g/L和150 g/L PEG 處理,遷移率分別 0.11、0.12、0.10和 0.11;POD3對照和各處理下遷移率一致均為0.050(表1)。遷移率的不同,說明SOD和POD同工酶分子量大小不同。由遷移率可以看出,尖葉胡枝子幼苗葉片在不同濃度PEG處理下,共有10種SOD同工酶基和6種POD同工酶基因表達(dá)。

2.2 不同濃度PEG脅迫對尖葉胡枝子幼苗葉片SOD和POD同工酶酶量及活性的影響

SOD和POD是細(xì)胞抵御活性氧傷害的膜保護(hù)系統(tǒng),在清除超氧自由基、過氧化氫和過氧化物及阻止或減少羥基自由基形成方面起重要作用。在水分脅迫下,植物細(xì)胞自由基產(chǎn)生和清除的平衡遭到破壞,過剩的自由基會傷害細(xì)胞膜系統(tǒng),因此,SOD、POD的活性與植物的耐旱能力密切相關(guān),其高低可以反映植物對干旱逆境抵御能力的大小。尖葉胡枝子幼苗葉片在50和100 g/L PEG濃度處理以及對照下,SOD和POD同工酶及總酶酶量逐漸在增加,其中,POD3在0～50 g/L PEG處理下,酶量下降,50～100 g/L PEG處理下,酶量增加。100～150 g/L SOD和POD同工酶及總酶量逐漸在降低(圖1)。隨著PEG脅迫程度的加深,尖葉胡枝子幼苗葉片SOD和POD活性均呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢。低脅迫水平使SOD和POD活性增加,高脅迫水平使SOD和POD活性降低。酶量和酶活性之間呈正相關(guān),酶量增加酶活性增大,酶量減少,酶活性下降。

圖1 PEG處理下尖葉胡枝子幼苗葉片SOD(左)和 POD(右)同工酶酶量的變化Fig.1 Effect of PEG on S OD and POD isozyme concentration in the seedling of Lespedeza hedysaroides

圖2 PEG處理下尖葉胡枝子幼苗葉片 S OD(左)和POD(右)同工酶酶活性的變化Fig.2 Effect of PEG on S OD and POD isozyme activity in the seedling of Lespedeza hedysaroides

3 結(jié)論與討論

SOD,CAT和POD是生物體內(nèi)的保護(hù)性酶,在清除生物自由基上擔(dān)負(fù)著重要功能,SOD能將O2-轉(zhuǎn)化為H2O2,而CAT和POD可將H2O2進(jìn)一步清除產(chǎn)生H2O,三者協(xié)同作用可使自由基維持在一個較低水平,從而避免膜傷害,達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。王娟等[14]報(bào)道,植物在水分脅迫初期SOD,CAT和POD活性升高,但隨著水分脅迫時(shí)間延長和強(qiáng)度增加,SOD,CAT及POD活性則不同程度下降,與此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)表明,PEG濃度在50～100 g/L時(shí),SOD和POD酶活性增加,PEG濃度為150 g/L,SOD和POD酶活性下降。說明適度水分脅迫能增強(qiáng)植物對干旱的適應(yīng)性,同時(shí)這兩種酶活性的協(xié)調(diào)變化,也顯示了植物生理過程變化的協(xié)調(diào)性。

研究表明,同工酶與作物抗旱性有一定的聯(lián)系[15],尖葉胡枝子幼苗水分脅迫后,葉片SOD、POD同工酶未出現(xiàn)新的酶帶,但酶譜遷移率大小不同,說明在不同脅迫下出現(xiàn)了不同酶的基因表達(dá)。共有10種SOD同工酶和6種POD同工酶基因表達(dá)。

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