孫敬禮，武 磊，黃 濤,李大全，劉賢俠

（1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆??石河子??832003；2.新疆克拉瑪依瑞恒畜牧開發(fā)有限責(zé)任公司，新疆??克拉瑪依??834000）

母豬的產(chǎn)仔數(shù)是一個重要的經(jīng)濟(jì)性狀，產(chǎn)仔數(shù)的高低直接影響到豬場的經(jīng)濟(jì)效益。因此，有效地提高豬的產(chǎn)仔數(shù)，特別是提高豬的產(chǎn)活仔數(shù)，一直是科學(xué)研究和養(yǎng)豬生產(chǎn)的主要任務(wù)之一。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)和現(xiàn)代繁育理論的不斷發(fā)展，從基因水平對豬高繁殖力機(jī)制進(jìn)行探討已成為一研究主題。骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是一種含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的分泌型糖基化磷蛋白,廣泛存在于乳汁、子宮、胎盤等組織和體液中,具有多種生物學(xué)活性。鑒于其在動物繁殖中的重要功能。，近年來，它成為在豬繁殖性狀的重要候選基因之一[1]。骨形成蛋白 15（bone?morphogenetic?protein-15，BMP15）是由卵母細(xì)胞分泌的一種生長因子，對早期卵泡的生長、分化和排卵起重要作用；許多研究表明BMP15可能具有促進(jìn)卵泡發(fā)育，防止黃體早熟的生物學(xué)功能[2]。目前，許多學(xué)者都將其作為控制產(chǎn)仔數(shù)的候選基因加以研究。本文主要分析大長雜交一代母豬OPN和BMP15不同基因型以及合并基因型對經(jīng)產(chǎn)母豬的產(chǎn)仔數(shù)差異，為利用DNA標(biāo)記輔助選擇方法提高母豬綜合繁殖性能提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

產(chǎn)仔2胎以上且記錄完備的大長雜交一代母豬樣本119頭,采自瑞恒公司豬場。前腔靜脈采血，EDTA抗凝。

1.2 DNA提取

采用苯酚-氯仿-異戊醇抽提方法提取DNA，置于-20?℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計

本研究所用引物分別參照Knoll等[3]、候振平等[4]所發(fā)表的引物序列由上海生工生物技術(shù)公司合成引物。OPN-F：5?-TCACCGATTTCCCCACCGACAC-3?；OPN-R ：5?-TGGCTGCGGGTTTCCACACTG-3?。BMP15-F ：5?-GATGCGTCTGCCACCTACAT?-3?；BMP15-R ：5?-?CCGGAACTCAAGAATCTCAC?-3?。

1.4 PCR擴(kuò)增

OPN、FSHβ和ESR基因采用相同的反應(yīng)體系：10×Buffer?2.5，μL，dNTP2μL,上、 下 游 引 物 各0.5?μL（10μmol/L），50?ng/μL 模 板 DNA?1μL，Taq 酶?1U，Mgcl2?2?μL，加雙蒸水至 25?μL。

OPN基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94?℃變性4?min，35 次循環(huán)（94?℃，40?s；60?℃，1?min；72?℃，1.1?min）,72?℃延伸 10?min。

BMP15基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:94℃變性4?min,?35 次 循 環(huán)（94?℃，30?s；58?℃，30?s；72?℃，30s）,72?℃延伸 10?min。

1.5 多態(tài)性檢測

OPN基因由片段插入造成，瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物即可見多態(tài)性，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠上顯示為 3種帶型 ：1295?bp、1295/990?bp和 990?bp， 分 別 為 AA、AB和 BB型。BMP15基 因采 用?PCR-RFLP 進(jìn) 行 分 析 ：8.5μL?PCR?產(chǎn) 物 加 入0.5?μL?Spe Ⅰ及 1.5?μL?10×Buffer，37℃水浴 4?h，酶切產(chǎn)物用2%的瓊脂糖電泳檢測分型：顯示1條帶（503??bp）的為 AA 型，顯示 2 條帶（277?bp、226?bp）的為 BB 基因型，顯示 3 條帶（503?bp、277?bp、226?bp）為 AB 基因型。

1.6 數(shù)據(jù)處理

整理基因型數(shù)據(jù)，計算所測豬群體OPN和BMP15基因不同基因型的基因型頻率、基因頻率，用SPSS13.0分析產(chǎn)仔數(shù)在各基因型間的差異顯著性，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型頻率和基因頻率

根據(jù)OPN、BMP15基因型檢出個數(shù)，計算基因型頻率和基因頻率，見表1。OPN基因AA型頻率最大，BB型頻率最小，AB在兩者之間，且A等位基因占優(yōu)勢，分別為0.673和0.327；BMP15基因BB型較少，AA型最多，A基因頻率為0.613，為優(yōu)勢等位基因。

2.2 OPN和BMP15基因與產(chǎn)仔數(shù)關(guān)系

根據(jù)大長雜交一代豬群中OPN基因和BMP15基因各基因型及其合并基因型檢出個數(shù)和對應(yīng)的經(jīng)產(chǎn)產(chǎn)仔數(shù)資料，計算OPN基因和BMP15基因與產(chǎn)仔數(shù)關(guān)系。

從表2可以看出，BB型產(chǎn)仔數(shù)比AA型高1.717頭，產(chǎn)活仔數(shù)比AA型高1.223頭；不同基因型間產(chǎn)仔數(shù)表現(xiàn)出BB＞AB＞AA的趨勢。AA型與BB型對豬的產(chǎn)仔數(shù)差異極顯著（P＜0.01）,但對豬的產(chǎn)活仔數(shù)差異顯著（0.01＜P＜0.05）。

由表3可以看出，AA和AB型個體對豬的產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)均高于BB型個體，AA型與AB型、BB型對豬的產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)差異顯著（0.01＜P＜0.05），AB型與BB型差異不顯著（P＞0.05）。

從表4可以看出，BMP15和OPN合并基因型中BBBB合并基因型對豬的產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)最高，分別為12.750和11.500；BBAA合并基因型產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)最低，產(chǎn)仔數(shù)只和BBAA、ABAA合并基因型差異不顯著（P＞0.05），和其他合并基因型差異極顯著（P＜0.01）。

表1 OPN和BMP15基因的基因型分布和頻率

表2 OPN基因與產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)系

表3 BMP15基因與產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)系

表4 BMP15和OPN合并基因型與產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)系

3 討論

OPN基因的多態(tài)性非常豐富，有研究表明，骨調(diào)素基因啟動子區(qū)存在9個（TG）n雙核苷酸的交替重復(fù)序列，是骨調(diào)素基因轉(zhuǎn)錄速率的主要區(qū)域[5]。Liaw[6]在約克夏、杜洛克、盤克夏和藍(lán)瑞斯母豬群體中共發(fā)現(xiàn)27種基因型；Southwood發(fā)現(xiàn)了13個等位基因。此外，在OPN基因的內(nèi)含子上也存在多態(tài)，Knoll[3]研究發(fā)現(xiàn)豬OPN基因的第6內(nèi)含子上有305?bp的缺失，并發(fā)現(xiàn)長白豬、皮特蘭豬上A等位基因占優(yōu)勢（0.57和0.82）,而大白豬和杜洛克豬的B等位基因占優(yōu)勢（0.74和0.84）。而本實驗結(jié)果表明A和B兩個等位基因在大長雜交一代母豬群體中均有分布，且A等位基因占優(yōu)勢；就基因型分布而言，AA基因型頻率最大，BB基因型頻率最小，AB在兩者之間；從表2可以看出，BB和AB型個體對豬的產(chǎn)仔數(shù)高于AA型個體。這與羅仍卓么等[5]的研究指出的在長白和大白豬種中，OPN優(yōu)良基因型為BB型是一致的。

關(guān)于BMP15基因位點對繁殖性能的影響已有相關(guān)報道，許多研究表明在綿羊中BMP15基因突變雜合體能引起排卵數(shù)的增加。儲明星等[7]研究表明BMP15FecXG突變雜合基因型小尾寒羊平均產(chǎn)羔數(shù)比野生純合基因型多0.62只或0.55只。侯振平等[4]研究發(fā)現(xiàn)，AA型母豬群體中，二花臉、梅山豬的產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)極顯著高于BB型母豬群體；AB型梅山豬群，頭胎產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)極顯著高于AA型和BB型母豬群體。本研究中，BMP15基因的3種基因型個體都檢測到了。另外，本研究表明，大長雜交一代豬的不同基因型母豬的總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)間差異顯著，從表3可以看出，AA產(chǎn)活仔數(shù)比BB高1.335頭；不同基因型間產(chǎn)仔數(shù)表現(xiàn)出AA＞AB＞BB的趨勢。這與侯振平等[4]和吳井生等[6]的研究指出的在梅山和大白豬種中，AA型母豬的產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)顯著高于BB型母豬群體是一致的。

從表4可以看出，BMP15和OPN合并基因型中AABB和BBBB合并基因型產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)均高于其它合并基因型，BBBB合并基因型最高，理論上應(yīng)是AABB合并基因型的最高，在本次研究中卻是BBBB合并基因型最高，這可能因為BBBB合并基因型的樣本量太少有關(guān)，頭數(shù)只有4個，其與產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)系需進(jìn)一步加大樣本量。BBAA合并基因型產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)最低；這與理論上是一致的。因此，對于OPN基因而言，B等位基因均可視為增加產(chǎn)仔數(shù)的優(yōu)勢基因。這和單獨應(yīng)用OPN基因型的分析結(jié)果[8]一致。對于BMP15基因而言，A等位基因可視為增加產(chǎn)仔數(shù)的優(yōu)勢基因。

從本次檢測結(jié)果來看，被檢測的大長雜交一代豬BMP15基因的有利基因A頻率較高，為0.613；但是OPN基因的有利基因B頻率較低，僅為0.327；在隨后的育種生產(chǎn)實踐中，我們將根據(jù)基因檢測結(jié)果，結(jié)合產(chǎn)仔記錄和生產(chǎn)性能，選擇OPN為BB基因型和BMP15為AA基因型的母豬和后備豬，改善生產(chǎn)母豬繁殖力的遺傳基礎(chǔ)，加快繁殖力性狀的遺傳進(jìn)展，增加母豬的窩產(chǎn)仔數(shù)，以提高生產(chǎn)水平和經(jīng)濟(jì)效益。

[1]?Yin?Li,?He?Z?Q?and?Zhong?G.Osteopontin,?it′ s?receptor?and?the?reproduction?(J).?Progressin?Obstetrics?and?Gynecology,?2005,14(3):239 ～ 240

[2]?吳井生，朱孟玲.骨形成蛋白15基因BcuI多態(tài)性對豬產(chǎn)仔性能的影響［J］.畜牧與獸醫(yī)，2009，41（3）：19.

[3]?Knoll? A,? Stratil? A,? Cepica? S? and? Dvorak? J.?Lengthpolymorphism?in?an?intron?of?the?porcine?osteopontin?(SPP1)gene?is?caused?by?the?presence?or?absence?of?a?SINE?(PRE-1)element?(J).?Animal?Genetics,?1999,?30:466

[4]?候振平，印玉龍，等.豬骨形成蛋白15基因編碼區(qū)序列的克隆及測序研究［J］.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，25（2）：91.

[5]?羅仍卓么，王立賢，孫世鐸.豬OPN基因與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析［J］.農(nóng)業(yè)生物科技學(xué)報，2008，16（3）：412-416.

[6]?Liaw?R?B,?Chang?H?L,?Lai?Y?Y,?Liu?C?T?and?Wu?M?C.? Influence? of? sows'? osteopontin? alleles? to? their? litter?performance?(J).Journal?Chinese?Society?of?Animal?Science,?2000,?29(Suppl.):?131

[7]?儲明星，桑林華，王金玉，等.小尾寒羊高繁殖力候選基因BMP15和GDF9的研究[J].遺傳學(xué)報，2005，32（1）：38-45.

[8]?孟慶利，劉鐵錚.豬骨調(diào)素基因多態(tài)性對產(chǎn)仔性狀的影響［J］.家畜生態(tài)學(xué)報，2005，26（3）：13-16.