盧 紅,樊青霞,王瑞林

(1河南大學(xué)淮河醫(yī)院,河南開封 475001；2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

臨床發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞的耐藥性嚴(yán)重影響了食管鱗癌患者的化療效果。在前期實驗中,我們成功誘導(dǎo)了人食管鱗癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株 Ec9706/P-1[1]。2006年 12月 ～2007年 6月,我們觀察了 β-微管蛋白Ⅲ(TUBB3)反義寡核苷酸(ASODN)對 Ec9706/P-1耐藥性的影響,并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 Ec9706/P-1,Lipofectamin2000,RT-PCR一步法試劑盒,鼠抗人 β-TubulinⅢ單克隆抗體,SP-9000免疫組化試劑盒,紫杉醇,TUBB3-ASODN及其無義寡核苷酸(NSODN)均由北京賽百盛公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組 取對數(shù)生長的 EC9706/P-1細(xì)胞,制備單細(xì)胞懸液,計數(shù)種板后分為 A、B、C三組。A組不處理,B、C組分別加入 NSODN、TUBB3-ASODN轉(zhuǎn)染 24 h,參考 Lipofectamin2000說明書操作。每組設(shè) 4個復(fù)孔。

1.2.2 細(xì)胞耐藥情況觀察 采用 MTT法。各組加入 100、10、1、0.1、0.001 μg/ml的紫杉醇培養(yǎng) 24 h,再加入 MTT溶液培養(yǎng) 4 h,棄上清。加入 DOSM,振蕩10 min,用酶標(biāo)儀檢測 490 nm波長處各孔的吸光度(A值),重復(fù) 3次。細(xì)胞抑制率 =(1-實驗組 A值 /親本細(xì)胞A值)×100%。以藥物濃度為橫坐標(biāo),細(xì)胞抑制率為縱坐標(biāo),按作圖法計算細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(IC50)。耐藥指數(shù)(RI)=耐藥細(xì)胞 IC50/親本細(xì)胞系EC9706細(xì)胞 IC50。

1.2.3 細(xì)胞周期檢測方法 用 0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞,計數(shù) 1×106個細(xì)胞,PBS沖洗 2遍,以 70%乙醇固定,進行 PI染色,過濾標(biāo)記熒光,于流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞周期。

1.2.4 TUBB3蛋白檢測方法 采用免疫細(xì)胞化學(xué)法,按試劑盒說明書操作。光鏡下每高倍視野(×400)隨機觀察 100個細(xì)胞,以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞,計算陽性細(xì)胞所占百分比。

1.2.5 TUBB3 mRNA檢測方法 收集各組細(xì)胞,分別抽提總 RNA,參照一步法 RT-PCR試劑盒說明書進行 RT-PCR擴增。應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)測定各組光密度(OD)值,以 TUBB3與 β-actin的 OD比值表示 TUBB3 mRNA相對表達量。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS11.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)比較采用成組 t檢驗。P≤0.05作為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞耐藥情況比較 C組紫彬醇 IC50為(7.78±1.15)μg/ml、RI為 3.37,B組分別為(16.56±1.80)μg/ml、7.17,A組分別為(15.40±2.06)μg/ml、6.67,C組與 A、B組比較,P均 ＜0.05。

2.2 各組細(xì)胞周期檢測結(jié)果比較 C組 G0+G1期細(xì)胞百分比為 78.7% ±2.3%,S期為 14.3% ±2.1%,G2+M期為 7.0% ±0.9%；B組分別為87.3%±1.2%、6.9%±0.4%、5.8%±0.8%,A組分別為85.9% ±1.1%、7.5% ±0.5%、6.7% ±0.9%,C組 G0+G1期、S期細(xì)胞百分比與 A、B組比較,P均 ＜0.05。

2.3 各組 TUBB3蛋白及其 mRNA表達比較 C組 TUBB3蛋白陽性率為 33.68%±8.34%、TUBB3 mRNA相對表達量為 1.33±0.08,B組分別為62.96%±10.49%、1.59±0.06,A組分別為64.47%±11.75%、1.60±0.10,C組與 A、B組比較相比,P均 ＜0.05。

3 討論

紫杉醇是從紅豆杉樹皮中提取的一種抗微管藥物,廣泛用于腫瘤的治療。微管是真核細(xì)胞的一種纖維蛋白,與細(xì)胞的有絲分裂密切相關(guān)。紫杉醇在與微管蛋白質(zhì)結(jié)合,形成穩(wěn)定的微管束,并使之不被解聚,促進其聚合,從而使腫瘤細(xì)胞停止在 G2期和M期,抑制細(xì)胞復(fù)制,阻止癌細(xì)胞增殖。但隨著藥物的使用,逐漸發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞對其耐藥性增加。

紫杉醇耐藥與細(xì)胞內(nèi)微管蛋白及其同型的變化有關(guān)[2],這些變化包括微管蛋白解聚、點突變、β-微管蛋白亞型表達改變、α-微管蛋白乙酰化,其中關(guān)于TUBB3的研究較多。Kamath等[3]研究發(fā)現(xiàn),在紫杉醇存在時,TUBB3高表達細(xì)胞株的微管活動被抑制的程度低于 β-微管蛋白Ⅰ高表達細(xì)胞株；而無紫杉醇時二者無差別,認(rèn)為 TUBB3通過降低紫杉醇抑制微管活動的能力導(dǎo)致細(xì)胞耐藥。Urano等[4]發(fā)現(xiàn),20例接受多烯紫杉醇治療的進展期胃癌患者,TUBB3低水平者療效較好。Mozzetti等[5]發(fā)現(xiàn),紫杉醇化療無效卵巢癌患者都存在 TUBB3在基因和蛋白水平高表達。

本研究將 TUBB3-ASODN體體外轉(zhuǎn)染 Ec9706/P-1后,TUBB3 mRNA及其蛋白水平明顯降低,并使Ec9706/P-1細(xì)胞對紫杉醇的敏感性增加,RI明顯降低。其原因可能是轉(zhuǎn)染 TUBB3后,微管蛋白穩(wěn)定性增加,微管平衡恢復(fù),從而使細(xì)胞有絲分裂正常進行,促進細(xì)胞周期的循環(huán),使 G1期細(xì)胞比例略有下降,S期細(xì)胞比例略有增加。C組提示 TUBB3在紫杉醇耐藥過程中可能起關(guān)鍵作用,即反向證明了TUBB3高表達是導(dǎo)致細(xì)胞對紫杉醇耐藥的因素之一,但具體機制有待進一步研究。

[1]盧紅,樊青霞,王瑞林,等.耐紫杉醇食管鱗癌 Ec9706/P-1的建立及特征[J].中國腫瘤臨床,2007,34(13):731-734.

[2]Rosell R,Taron M,Sarries C,et al.β-Tubulin mutational analysis:tantalizing findings[J].Lung Cancer,2002,35(1):11-17.

[3]Kamath K,Wilson L,Cabral F,et al.BetaIIItubulin inducespaclitaxel resistance in association with reduced effects on microtubule dynamic instability[J].J Biol Chem,2005,280(13):12902-12907.

[4]Urano N,Fujiwara Y,Doki Y,et al.Clinical significance of class III beta-tubulin expression and its predictive value for resistance to docetaxel-based chemotherapy in gastric cancer[J].Int J Oncol,2006,28(2):375-381.

[5]Mozzetti S,Ferlini C,Concolino P,et al.Class III beta-tubulin overexpression is a prominent mechanism of paclitaxel resistance in ovarian cancer patients[J].Clin Cancer Res,2005,11(1):298-305.