方 濤,初向陽

(解放軍總醫(yī)院胸外科,北京,100853)

根據(jù)WHO統(tǒng)計(jì),肺癌已經(jīng)成為全球男性和女性的第一癌癥殺手,造成了沉重的社會負(fù)擔(dān)。肺癌也是我國發(fā)病率最高的癌癥,年發(fā)病率為35/10萬人。早期肺癌往往缺乏明顯癥狀,60%～85%非小細(xì)胞肺癌患者無法進(jìn)行根治性切除,使用常規(guī)化療只能略微改善癥狀而無法獲得長期療效。吉非替尼(Gefitinib)起初作為表皮生長因子受體(EGFR)阻滯劑用于化療難治性非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的姑息治療,它對一小部分NSCLC患者有快速、顯著的療效。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),這些患者絕大部分存在內(nèi)皮生長因子(EGF)基因突變[1]。有關(guān)EGFR突變與腫瘤發(fā)生以及EGFR突變在分子靶向治療中的作用日益受到人們的關(guān)注?，F(xiàn)就EGFR突變在肺癌發(fā)生中的分子機(jī)制及分子靶向治療的臨床研究近況進(jìn)行介紹。

1 內(nèi)皮生長因子受體(EGFR)

內(nèi)皮生長因子受體(EGFR)是一種蛋白酪氨酸激酶受體(RTK),位于第7號染色體p13～q22區(qū),全長200 kb,由28個外顯子組成,編碼1186個氨基酸[2],其糖蛋白分子量約l70 kDa[3],廣泛分布于除成熟骨骼肌細(xì)胞、體壁內(nèi)胚層和造血組織以外的所有組織細(xì)胞。EGFR家族有4個結(jié)構(gòu)相似的受體分子:ErbB1(EGFR)、ErbB2(HER2)、ErbB3(HER3)、ErbB4(HER4),同屬于受體酪氨酸激酶(RTKS)。它們都含有1個胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,1個跨膜結(jié)構(gòu)域和1個具有酪氨酸激酶活性的胞漿結(jié)構(gòu)域。其胞內(nèi)區(qū)域與erbB癌基因產(chǎn)物高度同源[4]。

EGFR的活化可以通過配體誘導(dǎo)的受體二聚化作用實(shí)現(xiàn)。ErbB受體家族中,除了HER2外,其他成員都有其相應(yīng)配體,各種各樣的配體是由對應(yīng)的跨膜蛋白前體經(jīng)過蛋白水解而來的,都有1個EGF樣結(jié)構(gòu)域。與EGFR特異性結(jié)合的配體包括表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子α(TGFα)、雙向調(diào)節(jié)蛋白(AR)、β-細(xì)胞素(BTC)、肝素結(jié)合EGF樣生長因子(HB-EGF)、表皮調(diào)節(jié)素(EPR)等[5]。

胞外配體EGF(內(nèi)皮生長因子)與ErbB2特異性結(jié)合后引起ErbB2構(gòu)型改變,導(dǎo)致受體二聚化從而活化它們的胞漿位點(diǎn)。ErbB2的胞內(nèi)區(qū)域酪氨酸磷酸化后進(jìn)而活化第二信使轉(zhuǎn)導(dǎo),通過MAPK(絲裂原蛋白激酶)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞外信號的活化(調(diào)節(jié)激酶Erkl和 Erl):通過PDK(磷脂酰肌醇激酶)途徑活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子JAK;進(jìn)一步啟動STAT1、STATS3的轉(zhuǎn)錄活化子;另一方面,細(xì)胞內(nèi)信號通過Grb2(生長因子受體結(jié)合蛋白)活化下游的ERK(細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶),進(jìn)而介導(dǎo)ATF,NF-κ B,Ap-1,c-fos和 c-Jun的轉(zhuǎn)錄活化。這些都是EGFR所介導(dǎo)的生長作用或致癌的基本下游途徑。

異常的EGFR活化機(jī)制包括受體本身的擴(kuò)增、受體配體的過表達(dá)、活化突變以及負(fù)性調(diào)節(jié)途徑的缺乏,因此EGFR誘導(dǎo)癌癥至少通過3種機(jī)制:EGFR配體的過表達(dá),EGFR的擴(kuò)增或EGFR的突變活化[6]。在這3種機(jī)制中,EGFR的突變活化是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞異常生物學(xué)行為的最主要因素。

EGFR基因的某些突變會導(dǎo)致受體效果增強(qiáng)和持續(xù)時間的延長。Lynch等證明變異受體并不影響受體蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,通過Tyr1068磷酸化測定EGFR活化發(fā)現(xiàn),野生型受體的活化15 min即下調(diào),而變異受體表現(xiàn)出比正常EGFR高2倍的效應(yīng),且超過3 h的持續(xù)活化[7]。

2 EGFR突變與TKI的治療效果

EGFR突變并沒有影響腫瘤細(xì)胞與TKI(酪氨酸激酶抑制劑)結(jié)合的能力。TKI對那些因突變而導(dǎo)致EGFR活化的原因可以通過oncogene addiction模型來解釋。通過 Ras.Raf-MEK.ERK1/ERK2、PI3K.Akt、STAT3/STAT5 通路,EGFR突變高度激活下游信號,啟動EGFR調(diào)節(jié)抗凋亡和生存信號,導(dǎo)致癌癥細(xì)胞變得依賴此信號以維持其生存——即具有癌基因(突變的EGFR)依賴的特征;當(dāng)使用特異性 TKI阻斷EGFR信號后,將消除其增殖性影響和輸出生存信號,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。因此認(rèn)為,癌癥細(xì)胞中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變異是出現(xiàn)藥物高敏感的基礎(chǔ)。相反,正常細(xì)胞或非EGFR依賴的腫瘤細(xì)胞(對Gefitinib、Erlotinib無反應(yīng))不受影響。因?yàn)樯孢€受其他基因驅(qū)使,或者在EGFR抑制后能被其他的RTK所彌補(bǔ)。

在癌基因依賴模型中,細(xì)胞癌癥依賴的癌基因可以同時產(chǎn)生凋亡和生存2個信號的輸出。一般情況下,癌基因被激活。生存信號占主導(dǎo)地位,而凋亡信號處于相對低水平,使癌癥細(xì)胞維持生長和增殖。當(dāng)癌基因急性失活后,在關(guān)鍵的窗口期,首先是生存迅速大幅度減弱。而凋亡信號緩慢下降。因此導(dǎo)致信號不平衡(凋亡信號占主導(dǎo)),啟動細(xì)胞發(fā)生不可逆的凋亡[8]。

研究發(fā)現(xiàn)用酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼(gefitinib)/厄洛替尼(Erlotinib)治療NSCLC患者,大約 10%患者表現(xiàn)出迅速而滿意的臨床效果,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這些患者絕大部分存在EGFR基因突變。在目前已知與 EGFR-TKI(內(nèi)皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑)有關(guān)的基因突變局限于如下幾種:G719X(18外顯子),E746-A450缺失(19外顯子),L858R(21外顯子),L861Q(21外顯子),T790M(20外顯子)和D770-N771(20外顯子)。其中E746-A450缺失和L858R的突變與TKI的療效高度相關(guān)。

Mitsudomi T,Yatabe Y對568例非小細(xì)胞肺癌患者的分析結(jié)果:在所有非小細(xì)胞肺癌患者中大約90%的EGFR基因突變集中于19或21外顯子中,其中19外顯子的缺失突變及21外顯子中的點(diǎn)突變的患者服用EGFR-TKI的有效率均達(dá)到70%以上[9]。

近來的研究提示,EGFR外顯子20的插入性突變(D770-N771)可以使受體對 EGFRTKI的敏感性降低100倍,臨床上也發(fā)現(xiàn)具有此突變的患者對EGFR-TKI治療反應(yīng)不明顯[10]。

對外顯子20的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行亞克隆分析發(fā)現(xiàn),T790M突變是一個堿基對發(fā)生從胞嘧啶核苷(C)到胸腺嘧啶核苷(T)的改變,在蛋白水平就是EGFR酪氨酸激酶功能域790位點(diǎn)的蘇氨酸被蛋氨酸取代(T790M),這種突變可使EGFR重新處于被激活狀態(tài),從而導(dǎo)致TKI的獲得性耐藥,耐藥的原因是突變導(dǎo)致EGFR結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,使TKI與其結(jié)合出現(xiàn)位阻效應(yīng)[11]。為了進(jìn)一步證實(shí)第二種突變導(dǎo)致患者對Gefitinib耐藥,Kobayashi S等進(jìn)行了體外試驗(yàn),研究者將構(gòu)建的T790M突變片斷轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中,用不同濃度的Gefitinib(從0～2 mol/L)處理轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,然后采用Western-blotting方法,檢測磷酸化EGFR的表達(dá)情況。結(jié)果證實(shí)發(fā)生T790M突變的細(xì)胞對Gefitinib耐藥[12]。

KRAS是EGFR下游的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子。15%-30%的NSCLC存在KRAS密碼子12和13突變,與患者的預(yù)后差相關(guān)。有研究提示KRAS突變可能是Gefitinib、Erlotinib原發(fā)耐藥的原因。Helena linardou的Meta分析中總結(jié)了1008例NSCLC患者的TKI治療效果,在發(fā)生K-ras突變的165名患者中,94%的患者對TKI治療無明顯反應(yīng)[13]。

一般來講,KRAS和 EGFR突變NSCLC是相互排斥的.在不同的腫瘤亞型中存在明顯差異:EGFR突變主要見于不吸煙者,而KRAS突變更常見于吸煙相關(guān)的癌癥。因?yàn)镵RAS突變總是發(fā)生于具有野生型EGFR的NSCLC中,所以難以區(qū)分對EGFR—TKI不敏感到底是因?yàn)镵RAS突變,還是因?yàn)闊oEGFR突變。

3 EGFR突變與臨床相關(guān)因素

目前的研究表明EGFR突變與性別、種族、吸煙、病理類型有關(guān),在東方人群、女性、非吸煙、腺癌的患者中變異發(fā)生率較高[14-16]。

Haneda研究了112例手術(shù)治療的腺癌患者,年齡范圍為38～82歲,平均年齡64.3歲,包括70名男性和42名女性,其中男性中非吸煙者49名(44%),吸煙者11名(15%),女性中非吸煙者38名(90%),在112例患者中發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)48例患者病理為腺癌合并細(xì)支氣管肺泡癌成分(包括腺癌合并細(xì)支氣管肺泡癌成分和細(xì)支氣管肺泡癌),其中28例存在EGFR突變,其他的64例患者中有24例存在EGFR突變,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明EGFR突變與腺癌合并細(xì)支氣管肺泡癌成分相關(guān)(P=0.0358)。Haneda還分析了性別和吸煙的影響,認(rèn)為在病理類型為腺癌合并細(xì)支氣管肺泡癌成分的男性患者中具有較高的EGFR突變率(P=0.0135),就整個患者群體而言,非吸煙患者較吸煙患者有較高的EGFR突變率(P=0.001),但在女性人群中,是否吸煙與EGFR突變無明顯關(guān)聯(lián)(P=0.999)[17]。

Yano[18]觀察了32名具有EGFR突變的腺癌患者與48例無EGFR突變的患者的薄層掃描CT對比,分析了腫瘤直徑、毛玻璃征比例、胸膜切跡、邊緣毛刺、血管聚集與EGFR突變的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)在女性患者中,腫瘤直徑<3 cm,毛玻璃征比例>50%,有較高的EGFR突變率(11/12),但由于病例數(shù)少,尚有待證實(shí)。

Haneda[19]收集了95例直徑小于2 cm的周圍型腺癌標(biāo)本,將標(biāo)本分為2組,一組以腫瘤生長取代正常的肺泡細(xì)胞并有不同程度的肺纖維化為病理特征,另一組為肺泡細(xì)胞正常生長,沒有破壞性生長,發(fā)現(xiàn)在前者(47.1%)中較后者中(16%)更易發(fā)現(xiàn)EGFR突變。

綜上所述,東方人群、女性、非吸煙、腺癌與EGFR突變相關(guān),在近期研究發(fā)現(xiàn)腺癌中含細(xì)支氣管肺泡癌成分、腫瘤直徑、影像表現(xiàn)毛玻璃征等也可以作為存在EGFR突變的依據(jù)。

4 EGFR的檢測方法

4.1 DNA測序法

基因測序是檢測基因突變的標(biāo)準(zhǔn)與可靠的方法。但過程較復(fù)雜:獲取腫瘤組織、分離腫瘤細(xì)胞、提取核酸和進(jìn)行測序,所需時間長,費(fèi)用高,對取材和技術(shù)要求都比較嚴(yán)格,因此應(yīng)用于臨床仍受到一定程度的限制。在中國有基因公司專門提供EGFR基因突變的檢測,盡管避免了操作的限制和縮短了成果的時間,但費(fèi)用昂貴。

4.2 PCR-酶切法

PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))是進(jìn)行核酸擴(kuò)增的有效方法。該方法基于已知的突變類型設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物,然后根據(jù)PCR產(chǎn)物的性質(zhì)(有無或大小)來判斷特異性突變的存在。該方法分為兩步進(jìn)行,首先利用限制性內(nèi)切酶去選擇性消化野生型的EGFR基因片斷,從而使反應(yīng)體系中突變型EGFR基因片斷得到富集,再通過PCR放大和凝膠電泳來進(jìn)行突變的判斷。該法降低了對檢測組織的要求,大大地提高了突變檢測的靈敏度。PCR-酶切法無需測序,但只能針對已知的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行檢測[20]。

4.3 PCR-SSCP

PCR-SSCP(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一單鏈構(gòu)象多態(tài)性)是一種經(jīng)典的檢測基因突變的方法,原理為:單鏈DNA由于有鏈內(nèi)堿基配對而具有一定的空間構(gòu)象,當(dāng)DNA鏈上的堿基發(fā)生改變時,單鏈DNA會形成不同的構(gòu)象,即單鏈構(gòu)象多態(tài)性。在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中,不同構(gòu)象的DNA分子具有不同的泳動速度。單鏈DNA分子的相對遷移率不僅與DNA分子的大小有關(guān),而且與其構(gòu)象有關(guān)。與測序法比較,該方法敏感性高,可以發(fā)現(xiàn)測序未能發(fā)現(xiàn)的突變。但PCRSSCP也有它固有的局限性,電泳時間較長,操作步驟比較繁瑣,且只能進(jìn)行定性的分析。

4.4 ScorpionsARMS

Scorpions ARMS(蝎形探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng))使用熒光標(biāo)記的Scorpion引物進(jìn)行PCR Scorpion引物含有一個特殊的探針序列,5′和3′端由互補(bǔ)的序列形成一個發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu),從而在不同的擴(kuò)增位點(diǎn)中止復(fù)制。大量終止于不同擴(kuò)增位點(diǎn)的熒光引物經(jīng)過電泳和分析后可以快速的得出結(jié)論。與直接測序法相比,ARMS法特異性接近,而敏感性更高,但該方法尚未獲得批準(zhǔn)進(jìn)入臨床,目前僅有少數(shù)研究機(jī)構(gòu)可以進(jìn)行。

綜觀以上所有方法,目前直接測序法仍是突變檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。相對于DNA測序法,其它分子生物學(xué)方法各有其優(yōu)缺點(diǎn),臨床上亟待一種簡便、快速、準(zhǔn)確和經(jīng)濟(jì)的肺癌EGFR基因突變檢測方法的出現(xiàn),為肺癌個體化治療服務(wù),為肺癌病人造福。筆者認(rèn)為ARMS法進(jìn)入臨床后會有較好的應(yīng)用前景。

5 近期大規(guī)模臨床試驗(yàn)結(jié)果

5.1 IPASS實(shí)驗(yàn)

IPASS(Iressa Pan-Asia Study):一項(xiàng)評價吉非替尼(易瑞沙)(250 mg片劑)對比卡鉑紫杉醇雙藥化療一線治療臨床選擇的亞洲晚期(ⅢB或Ⅳ期)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的療效、安全性和耐受性的開放、隨機(jī)、平行、多中心、Ⅲ期臨床研究。

對于有EGFR突變的患者,吉非替尼組的PFS明顯優(yōu)于化療組,相反,對于沒有EGFR突變的患者,化療組的PFS明顯優(yōu)于吉非替尼組;從有效率上看,沒有EGFR突變的患者接受吉非替尼治療的有效率竟然低至1.1%,不僅低于有EGFR突變患者接受吉非替尼治療的71.2%,也顯著低于化療組的47.3%和23.5%。

結(jié)果表明:只有選擇 EGFR基因突變的患者,行一線吉非替尼靶向治療,才可能實(shí)現(xiàn)真正的個體化治療;若對患者不加選擇地使用EGFR-TKI,則EGFR突變陰性的患者生存期明顯縮短。

5.2 SATURN實(shí)驗(yàn)

Cappuzzo報(bào)告的SATURN研究的數(shù)據(jù),1949例晚期NSCLC患者接受了含鉑兩藥化療方案;889例患者在治療后疾病無進(jìn)展。收集這些患者的腫瘤組織,并根據(jù)EGFR表達(dá)、分期(ⅢB、Ⅳ期)、PS評分、化療方案和吸煙史進(jìn)行分層?；颊唠S機(jī)分配至厄洛替尼組或安慰劑組接受治療,直至疾病進(jìn)展。

厄洛替尼組的PFS率顯著高于安慰劑組(HR=0.71,95%CI 0.62～0.82,P=0.000003),而免疫組化EGFR陽性患者中該HR為0.69,其疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)降低29%～31%,PFS延長41%～45%。厄洛替尼治療的有效率為40.8%,而安慰劑組僅為27.4%(P<0.0001)。

厄洛替尼組的毒性反應(yīng)較小,患者可耐受。且亞組分析顯示,對于各人群(無論性別、PS評分、EGFR表達(dá)和種族),厄洛替尼均顯示有效。

5.3 META分析

Shepherd等對 INTEREST、V-15-32、SIGN和ISTANA這4項(xiàng)研究中的2257例患者進(jìn)行了Meta分析,分析顯示吉非替尼治療者的OS和PFS與多西他賽治療者相似,而ORR優(yōu)于后者;在亞裔人群中,兩組的OS相似,但PFS(P<0.05)和ORR(P<0.001)均優(yōu)于多西他賽組。研究者認(rèn)為,與多西他賽相比,吉非替尼療效略佳,毒副反應(yīng)小,患者生活質(zhì)量(QOL)較高,且其口服方便,因此,無論亞裔抑或廣泛人群都可能從中獲益。

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