■ 趙娟 夏淑鴻 張向榮 劉維華 寧夏獸藥飼料監(jiān)察所

1 前言

2009年，衛(wèi)生部公布了《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單（第二批）》，其中包含生乳中非法添加皮革水解蛋白。皮革水解蛋白是皮革“鞣革”工藝中產(chǎn)生的下腳料，將其摻入到生乳中可以增加蛋白質(zhì)含量，但會(huì)改變生乳的口感及氨基酸的組成，降低生乳中氨基酸的吸收利用率。尤其“鞣革”下角廢料中含有的重金屬鉻，如果被人體吸收蓄積，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)疏松、關(guān)節(jié)腫大，造成人體重金屬中毒。

由于L－羥脯氨酸是動(dòng)物皮骨的膠原蛋白構(gòu)成的特征氨基酸，通過(guò)水解可以將乳蛋白和其他動(dòng)物皮骨的膠原蛋白區(qū)別開(kāi)來(lái)，因此鑒定L－羥脯氨酸就是鑒定皮革水解蛋白，即檢測(cè)到了L－羥脯氨酸就證明使用了動(dòng)物膠原蛋白類產(chǎn)品。

L－羥脯氨酸，又名反式-4-羥基-L-脯氨酸（trans-4-hydroxy-L-proline），分子式C5H9NO3，分子量為131.13。截至2010年5月，“生鮮乳中皮革水解蛋白檢測(cè)方法”的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或者行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)均未發(fā)布實(shí)施。目前，實(shí)驗(yàn)室通常參考“乳與乳制品中動(dòng)物水解蛋白鑒定方法—比色法”、“生鮮乳中羥脯氨酸的測(cè)定—氨基酸分析儀法”、“皮革水解物檢測(cè)方法—硝酸汞沉淀顯色法”進(jìn)行檢測(cè)。氨基酸分析儀價(jià)格較為昂貴，實(shí)驗(yàn)室配備率不高，而紫外分光光度計(jì)是實(shí)驗(yàn)室常用儀器。本文中，筆者用UV法測(cè)定了生乳中L-羥脯氨酸的殘留，并進(jìn)行了方法學(xué)考察。

2 試驗(yàn)方法

2.1 主要儀器設(shè)備

Shimadzu UV2410pc 紫外分光光度儀；高速冷凍離心機(jī)(HITACHI)；N-EVAPTM氮吹儀；移液器（Finnpipette）；CFYQYB YLE-1000水浴鍋；GZX-DH-30X35-BS電熱恒溫干燥箱；具塞玻璃比色管。

2.2 主要試劑

OMEGA-ORACLE L-羥脯氨酸：含量99.5%～101.5%，BIOSZUNE QC DEP提供，批號(hào)817k09266；氯胺T（批號(hào)20060831）、對(duì)二氨基苯甲醛（批號(hào)20010103）、鹽酸（優(yōu)級(jí)純，批號(hào)20091021）、苯酚（重精餾，批號(hào)20100122）均為天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；檸檬酸、氫氧化鈉、結(jié)晶乙酸鈉、正丙醇均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

2.3 溶液制備

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取L-羥脯氨酸對(duì)照品50mg置于100mL棕色量瓶中，加水充分溶解并稀釋至刻度，搖勻即得L-羥脯氨酸儲(chǔ)備液（濃度500μg/mL）；精密量取儲(chǔ)備液5mL，置50mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻即得L-羥脯氨酸中間液（濃度50μg/mL）。

分別精密量取L-羥脯氨酸中間液0、1.00、2.00、3.00、4.00mL，置100mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，得0、0.5、1.0、1.5、2.0μg/mL的L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.3.2 試劑配制

氯胺T反應(yīng)液（臨用現(xiàn)配）：由7%的氯胺T水溶液、正丙醇和緩沖液混合而成（20：26：54）；緩沖液：稱取5.00g檸檬酸、2.63g氫氧化鈉和14.61g結(jié)晶乙酸鈉溶于水，稀釋100mL。顯色液（現(xiàn)用現(xiàn)配）：稱取10g對(duì)二甲氨基苯甲醛，用35mL高氯酸溶解，緩慢加入65mL異丙醇。

2.4 陽(yáng)性添加試料的制備

精密量取L-羥脯氨酸儲(chǔ)備液（濃度500μg/mL）400μL、1000μL，置于5mL空白生乳樣品中，使之成為40μg/mL、100μg/mL的陽(yáng)性添加試料。

2.5 試料水解

準(zhǔn)確量取生乳5mL，置具塞比色管中，加優(yōu)級(jí)純濃鹽酸5mL，加入50g/L的重精餾苯酚水溶液3滴，混勻，靠近液面充入高純氮?dú)?min；在充氮?dú)鉅顟B(tài)下封口。將已封口的水解管放在110℃的恒溫干燥箱內(nèi)，水解6h后取出。打開(kāi)水解管，趁熱過(guò)濾于100mL容量瓶中，用水反復(fù)沖洗試管和濾紙，定容到刻度，混勻。吸取10mL于25mL燒杯中，加10mol/L氫氧化鈉溶液8滴，再用1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為8.0±0.2，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻備用，同時(shí)做試劑空白和陽(yáng)性添加。

圖1 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

圖2 L-羥脯氨酸最大吸收峰

2.6 試料的顯色

分別移取0、0.5、1.0、1.5、2.0μg/mL的L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液和待測(cè)水解液各5mL。置25mL具塞比色管中，加氯胺T反應(yīng)液2.00mL，搖勻室溫靜置20min。再加顯色劑2.00mL，搖勻，于60℃恒溫水浴20min，-15℃迅速冷卻15min，在波長(zhǎng)（560±2）nm處測(cè)定吸光值，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.7 計(jì)算

回收率計(jì)算公式：R=（Xs－B1）·K/X0·100%。式中，Xs：標(biāo)準(zhǔn)曲線查得添加試料吸光度對(duì)應(yīng)濃度（μg/mL）；X0：陽(yáng)性添加試料實(shí)際濃度（μg/mL）；K：稀釋倍數(shù)（100）；B1：標(biāo)準(zhǔn)曲線查得空白樣品吸光度對(duì)應(yīng)值（μg/mL）。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在波長(zhǎng)（560±2nm）處測(cè)定吸光值，做標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。得線性回歸方程為：

Conc=4.616X-0.300 R=0.9998

由圖1可見(jiàn)，0標(biāo)準(zhǔn)是有一定吸收值的，吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系，線性范圍為0～2.0μg/mL。

3.2 加標(biāo)回收率

在空白試料中做40μg/mL、100μg/mL 2個(gè)水平陽(yáng)性添加，每水平做4份平行樣品，每份結(jié)果取2次平均值，考察4批。生乳中L-羥脯氨酸的回收率、批內(nèi)變異系數(shù)、批間變異系數(shù)如表1、2所示。

表1 生乳中L-羥脯氨酸40μg/mL添加結(jié)果匯總

表2 生乳中L-羥脯氨酸100μg/mL添加結(jié)果匯總

3.3 穩(wěn)定性

3.3.1 測(cè)定時(shí)間的影響

對(duì)不同濃度的溶液室溫放置48h，測(cè)定其濃度，考察重復(fù)性或穩(wěn)定性。1h內(nèi)測(cè)定吸光度值變化不顯著。結(jié)果如表3所示。

表3 顯色后放置時(shí)間對(duì)L-羥脯氨酸待測(cè)溶液吸光度的影響

3.3.2 反應(yīng)液的影響

臨用現(xiàn)配和放置許久的氯胺T反應(yīng)液對(duì)測(cè)定結(jié)果影響較大，結(jié)果如表4所示。

表4 氯胺T反應(yīng)液對(duì)L-羥脯氨酸待測(cè)溶液吸光度的影響

3.3.3 水解時(shí)間的影響

同一空白樣品分別制備40和100μg/mL的L-羥脯氨酸陽(yáng)性添加各9批，分別在110℃的恒溫干燥箱內(nèi)，水解6、12和24h后取出。按2.5、2.6的方法水解顯色，測(cè)定吸光度值，并比較回收率。結(jié)果如表5所示。

表5 同一批樣品陽(yáng)性添加不同水解時(shí)間測(cè)定L-羥脯氨酸回收率結(jié)果

4 分析與討論

4.1 試樣經(jīng)酸水解，釋放出羥脯氨酸，經(jīng)氯胺T氧化，生成含有吡咯環(huán)的氧化物，顯色劑中含有的高氯酸破壞了過(guò)量的氯胺T，終止氧化。羥脯氨酸氧化物與對(duì)二甲氨基苯甲醛反應(yīng)生成紅色化合物，在波長(zhǎng)560nm處進(jìn)行比色，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較可以定量測(cè)定L－羥脯氨酸。L－羥脯氨酸是動(dòng)物皮骨的膠原蛋白構(gòu)成的特征氨基酸，其含量占10%以上，而乳蛋白中不含有此成分。通過(guò)水解可以將乳蛋白和其他動(dòng)物皮骨的膠原蛋白進(jìn)行區(qū)分，因此鑒定L－羥脯氨酸就是鑒定皮革水解蛋白，即檢測(cè)到了L－羥脯氨酸就證明使用了動(dòng)物膠原蛋白類產(chǎn)品。

4.2 由標(biāo)準(zhǔn)曲線得，UV法測(cè)定生乳中L-羥脯氨酸含量方法成立，在波長(zhǎng)（560±2）nm處有最大吸收（圖2），吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系，線性范圍0～2.0μg/mL；線性回歸方程為：Conc=4.616X-0.300，R=0.9998。

4.3 回收率試驗(yàn)結(jié)果表明，40μg/mL陽(yáng)性添加，L－羥脯氨酸平均回收率為100.0%（n=16），回收率范圍為87.3%～106.4%，4次考察批內(nèi)變異系數(shù)分別為2.1%、3.6%、2.1%和3.7%，批間變異系數(shù)為5.6%；100μg/mL陽(yáng)性添加，L－羥脯氨酸平均回收率100.4%（n=16），回收率范圍為92.7%～107.9%，4次考察批內(nèi)變系數(shù)分別為5.9%、3.6%、4.5%和4.8%，批間變異系數(shù)為1.3%。

4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，用UV法測(cè)定生乳中L-羥脯氨酸含量，顯色后吸收值測(cè)定應(yīng)在1h內(nèi)完成，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，測(cè)定值逐漸減小且不穩(wěn)定；氯胺T反應(yīng)液配制后的放置時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較大，要做到臨用現(xiàn)配；生乳酸化水解6、12和24h對(duì)L-羥脯氨酸回收率測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著影響，證明酸化6h可以滿足完全水解的目的。另外，不同品牌的標(biāo)準(zhǔn)品和分光光度儀機(jī)型可能引起L－羥脯氨酸最大吸收峰的漂移，建議做一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的掃描測(cè)定，確定吸收峰。因本檢測(cè)方法所用試劑和步驟較多，生乳空白樣品中含有一定量的L-羥脯氨酸，可能由檢測(cè)過(guò)程中使用的各種試劑引入。因此，使用該方法測(cè)定回收率時(shí)，同時(shí)應(yīng)做樣品空白；測(cè)定樣品時(shí)，同時(shí)做試劑空白，計(jì)算結(jié)果時(shí)要扣除。

本方法測(cè)定生乳中的L-羥脯氨酸含量，檢測(cè)條件穩(wěn)定，加標(biāo)回收率高，變異系數(shù)較小，對(duì)儀器要求低，應(yīng)用簡(jiǎn)單方便。該方法的研究對(duì)生乳中皮革水解蛋白鑒定標(biāo)準(zhǔn)的制定修訂提供了可靠的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)及科學(xué)依據(jù)，對(duì)質(zhì)檢機(jī)構(gòu)開(kāi)展生乳質(zhì)量安全檢測(cè)工作具有現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。