林 滬 陳黎明 施 明 王福生

間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cell，MSCs）為來(lái)源于中胚層間充質(zhì)的成體干細(xì)胞，主要存在于骨髓、臍帶血、臍帶、胎盤、外周血及肝臟等器官間質(zhì)和結(jié)締組織中。它們具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)作用、自我更新和跨胚層多向分化潛能等特點(diǎn)。它們能夠分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌原細(xì)胞以及神經(jīng)外胚泡等。特別是有實(shí)驗(yàn)證明MSCs分化成的肝細(xì)胞樣的細(xì)胞，具有正常肝細(xì)胞功能，如分泌尿素和白蛋白等。所以，MSCs移植治療肝病已成為國(guó)內(nèi)外干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。

一、MSCs治療肝病進(jìn)展

大量體內(nèi)外研究表明，MSCs可以促進(jìn)損傷肝臟修復(fù)、改善癥狀、提高存活率[1，2]，MSCs可以用于治療急性肝衰竭、終末期肝病和遺傳代謝性肝病。

（一）急性肝衰竭 肝衰竭的特點(diǎn)是短時(shí)間內(nèi)大量肝細(xì)胞的壞死和肝功能的急劇惡化，既往認(rèn)為，MSCs移植可以提供大量的干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞，從而替代正常肝臟所需要的合成和代謝功能。但近期研究發(fā)現(xiàn)，在組織修復(fù)方面，MSCs旁分泌機(jī)制改變組織微環(huán)境比MSCs向肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)化更重要，干細(xì)胞移植治療肝損傷受體，只是促進(jìn)其肝細(xì)胞的輕微增殖替代[1]。應(yīng)用MSCs移植治療肝衰竭大鼠模型的多個(gè)實(shí)驗(yàn)顯示[2～4]，MSCs可以分泌多種細(xì)胞因子，能夠抑制肝細(xì)胞凋亡、促進(jìn)肝細(xì)胞增殖及肝臟血管生成，抑制免疫細(xì)胞增殖及向肝臟遷移，能夠調(diào)節(jié)肝衰竭大鼠肝臟及全身免疫炎癥反應(yīng)，提高大鼠生存率。實(shí)驗(yàn)顯示[5]，MSCs移植到實(shí)驗(yàn)小鼠后第四周，其增殖數(shù)量?jī)H占受體肝細(xì)胞的1%～3%，提示在短時(shí)間內(nèi)治療急性肝衰竭，MSCs分化為肝細(xì)胞不可能是主要作用。

（二）終末期肝病 在肝硬化的患者肝組織中，假小葉的形成改變了肝內(nèi)的管道結(jié)構(gòu)，阻礙了肝細(xì)胞和血漿的交換，使細(xì)胞治療很困難。因此，理想的MSCs移植治療是重建肝內(nèi)管道系統(tǒng)，這需要移植MSCs的多向分化與增殖能力。多數(shù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MSCs移植能減輕肝纖維化、改善肝功能以及不同程度轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞[6]。MSCs治療終末期肝病的多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)顯示，對(duì)患者短期治療生活質(zhì)量和肝功有一定程度改善，然而，其效果與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)尚有一定差距。在伊朗，4例失代償肝硬化患者移植自身骨髓MSCs，無(wú)副作用發(fā)生，隨訪末生活質(zhì)量評(píng)分均提高，有2例患者的終末期肝病評(píng)分模型（MELD）評(píng)分及肝功得到改善[7]。經(jīng)外周靜脈或門脈將自身骨髓MSCs，移植給8例MELD評(píng)分≥10的肝硬化患者（4例乙型肝炎，1例丙型肝炎，1例酒精性，2例病因不明），6月后所有患者均耐受治療，MELD評(píng)分顯著下降，白蛋白增加，肝功得到改善[8]。但MSCs移植的臨床實(shí)驗(yàn)尚有缺陷，如病例數(shù)量較少，缺乏對(duì)照，缺乏遠(yuǎn)期療效和安全性分析等。

（三）遺傳代謝性肝病 細(xì)胞移植與基因治療的聯(lián)合應(yīng)用，是目前治療遺傳代謝性肝病的熱門課題，但目前僅限于動(dòng)物模型研究階段[9]。MSCs的基因修飾是將外源基因轉(zhuǎn)入MSCs，不影響MSCs特性，且可產(chǎn)生相應(yīng)的因子，從而更高效治療各種肝病。已證實(shí)多種因子如HGF、IL-3、VIII因子、IFN-β、生長(zhǎng)激素、CD-2等可以通過(guò)此種方法達(dá)到治療的目的。目前已見(jiàn)應(yīng)用干細(xì)胞成功治療遺傳代謝性疾病，包括Crigler-Najjar綜合征[10]、原發(fā)性全身性淀粉樣變性[11]等，尚無(wú)MSCs應(yīng)用于臨床的文獻(xiàn)，但MSCs因來(lái)源廣泛將可能成為最具效力的干細(xì)胞。

二、MSCs治療肝病的機(jī)制

MSCs除了具有多向分化潛能，更重要的是在損傷肝臟旁分泌一系列營(yíng)養(yǎng)因子，通過(guò)調(diào)節(jié)免疫減輕炎癥反應(yīng)、抗肝細(xì)胞凋亡、抗肝纖維化、促進(jìn)內(nèi)源性肝干細(xì)胞分化和刺激內(nèi)源性肝細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管增生等修復(fù)肝組織。故MSCs的旁分泌機(jī)制是其治療肝病的重要機(jī)制[12]。

（一）抗炎 MSCs在異基因移植中能長(zhǎng)期存活并發(fā)揮正常的生物學(xué)功能，原因主要有：①獨(dú)特的免疫表型：MSCs低表達(dá)MHCⅠ類分子，不表達(dá)MHCⅡ類分子、FasL和T細(xì)胞協(xié)同刺激分子B7等，故免疫原性很弱。實(shí)驗(yàn)證實(shí)MSCs在合適的體外分化條件下可以跨胚層分化為內(nèi)胚層的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，并且具有移植后不發(fā)生排斥反應(yīng)的特點(diǎn)[13]。②免疫調(diào)節(jié)作用：MSCs能夠分泌可溶性細(xì)胞因子介導(dǎo)免疫抑制及誘導(dǎo)免疫耐受。通過(guò)阻斷抗原遞呈細(xì)胞的成熟和功能、抑制B細(xì)胞分化、降低T細(xì)胞和NK細(xì)胞的免疫應(yīng)答能力，從而非特異性地抑制同種異基因淋巴細(xì)胞增殖。將包含大量因子的MSCs條件培養(yǎng)液，其中有胰島素樣生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素（IL）-8、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子（TNF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等，經(jīng)靜脈注入肝衰竭大鼠，肝臟組織學(xué)檢查示，小葉旁白細(xì)胞侵潤(rùn)、肝細(xì)胞壞死和膽管復(fù)制均明顯減少；CT檢查表明，MSCs條件培養(yǎng)液改變了白細(xì)胞的遷移，使白細(xì)胞繼發(fā)性從損傷肝臟轉(zhuǎn)移，說(shuō)明MSCs條件培養(yǎng)液可抑制免疫細(xì)胞增殖及向肝臟遷移，能夠減輕損傷肝臟的炎癥反應(yīng)，提高了大鼠存活率[1]。除了細(xì)胞免疫反應(yīng)，體液免疫反應(yīng)也是肝損傷炎癥反應(yīng)的重要組成，控制該反應(yīng)的關(guān)鍵是，減輕前炎性細(xì)胞因子如TNF-α和IL-1的細(xì)胞毒作用。MSCs分泌IL-1受體拮抗劑（IL-1RA），抑制前炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并上調(diào)抗炎細(xì)胞因子如IL-10[14]。

（二）抗凋亡 研究顯示，MSCs可通過(guò)旁分泌機(jī)制分泌相關(guān)細(xì)胞因子，如基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等，抑制各種類型受體細(xì)胞凋亡，其中SDF-1/CXCR-4軸具有重要調(diào)節(jié)作用。人骨髓MSCs植入肝衰竭大鼠體內(nèi)，大鼠明顯降低的死亡率與凋亡肝細(xì)胞數(shù)量減少相關(guān)[1]。在急性肝損傷大鼠模型[15]，靜脈灌注MSC條件培養(yǎng)液后，阻止了肝損傷生物標(biāo)記的釋放，使肝細(xì)胞凋亡減少90%，增殖期肝細(xì)胞數(shù)量增加3倍，體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)MSC條件培養(yǎng)液的直接抗凋亡和促進(jìn)肝細(xì)胞有絲分裂。

（三）抗纖維化 大量動(dòng)物及臨床實(shí)驗(yàn)證明[7，16]，MSCs移植能抑制肝細(xì)胞內(nèi)TGF-β1、平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）表達(dá)，減輕肝纖維化程度。MSCs移植抗肝纖維化的機(jī)制目前多數(shù)認(rèn)為，MSCs通過(guò)旁分泌機(jī)制調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）的功能，分泌抗纖維化物質(zhì)如HGF直接誘導(dǎo)HSC凋亡，分泌IL-10和TNF-α抑制HSC增殖及基質(zhì)合成[17]，移植的MSCs表達(dá)高水平的基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallo proteinase，MMP）-9直接降解 ECM[18]等減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積、抑制肝組織纖維化的形成。但MSCs移植抗纖維化尚有爭(zhēng)議，有實(shí)驗(yàn)證實(shí)[19]，MSCs移植入肝纖維化患者或小鼠體內(nèi)的MSCs傾向于分化為HSC和肌纖維母細(xì)胞，發(fā)揮促肝纖維化作用。

（四）分化 研究證明，干細(xì)胞所處的微環(huán)境是其定向分化的決定因素。細(xì)胞局部的微環(huán)境包括多種細(xì)胞因子、激素、基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)等，細(xì)胞因子的作用尤為重要，不同的細(xì)胞因子作用下MSCs可分化為不同的細(xì)胞類型。肝損傷局部微環(huán)境的改變，可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，促進(jìn)和增強(qiáng)MSCs的分化；另一方面，MSCs在損傷肝臟可反應(yīng)性分泌HGF、FGFs、TGF-β、EGF、IL-10等多種因子促進(jìn)損傷肝組織修復(fù)。MSCs通過(guò)磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidyl inositol-3-kinase，PI3K）、MEK、P38、核因子（nuclear factor，NF-κB）等機(jī)制，介導(dǎo)EGF受體和TNF受體間的交互作用，產(chǎn)生HGF、EGF、FGFs等因子[20-22]。其中，由非肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞或間充質(zhì)細(xì)胞分泌的HGF是誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞的關(guān)鍵因子，它通過(guò)與MSCs膜表面特異性受體c-Met結(jié)合，能促進(jìn)多種細(xì)胞的有絲分裂。

此外，F(xiàn)GFs、EGF、TNF-α、IL-3、IGF、干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）、制瘤素 M（oncostatin，OSM）、曲古菌素 A、內(nèi)毒素、糖皮質(zhì)激素、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉（insulintransferrin-sodium selenite，ITS）、尼克酰胺等也參與了MSCs向肝系的分化，與 HGF 起協(xié)同作用[23～25]。其中，HGF、FGFs在肝細(xì)胞的發(fā)育和增殖中有不可替代的作用。

（五）血管形成 理想的干細(xì)胞移植治療是修復(fù)或重建肝內(nèi)管道系統(tǒng)，即接近于正常肝臟功能需求的動(dòng)脈、門靜脈和膽道系統(tǒng)。MSCs具有跨胚層多向分化潛能，在合適的分化條件下，可以跨胚層分化為內(nèi)胚層的肝細(xì)胞樣細(xì)胞、膽管細(xì)胞和血管內(nèi)皮樣細(xì)胞[26]。但干細(xì)胞在肝臟管道形成中的確切作用尚有待進(jìn)一步研究。肝臟再生增殖與新生血管的形成有關(guān)，而MSCs可為新生血管及其側(cè)枝形成提供營(yíng)養(yǎng)支持。實(shí)驗(yàn)證實(shí)[27，28]，IGF-1、HGF、IL6、IL8、IL11、VEGF、FGF、單核細(xì)胞化學(xué)引誘蛋白（monocyte chemoattractant protein，MCP-1）、骨形態(tài)形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-2均促進(jìn)新生血管形成和改善器官缺血狀況。研究證實(shí)[29]，Notch/Jagged信號(hào)通路在MSCs向肝細(xì)胞樣細(xì)胞、膽管細(xì)胞和血管內(nèi)皮樣細(xì)胞的分化、成熟過(guò)程中起重要作用。

三、MSCs治療肝病的副作用

（一）致癌性 理論上，MSCs可通過(guò)直接轉(zhuǎn)化、抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)和對(duì)腫瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)作用等導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，具體機(jī)制尚不清楚。Wnt信號(hào)是生長(zhǎng)刺激信號(hào)，可促進(jìn)MSCs的增殖和分化，當(dāng)Wnt信號(hào)抑制，MSCs可導(dǎo)致肉瘤發(fā)生[30]。

（二）免疫能力下降 MSCs非特異性地抑制同種異體淋巴細(xì)胞增殖。臨床實(shí)驗(yàn)中，9名移值物抗宿主疾病患者經(jīng)MSCs移植后，有3例出現(xiàn)病毒感染[31]，提示MSCs所致免疫抑制可能導(dǎo)致機(jī)體對(duì)病原體免疫監(jiān)視的減弱。

（三）多向分化 有研究表明骨髓MSCs移植可引起鈣化或向骨骼分化[32]，也可分化為成纖維細(xì)胞表型[19]，故多分化潛能的不可調(diào)控性是骨髓MSCs主要缺陷。

四、問(wèn)題與展望

盡管關(guān)于MSCs的研究已取得較大進(jìn)展，但臨床廣泛應(yīng)用前尚有許多問(wèn)題尚待明確。首先，進(jìn)一步闡明MSCs移植治療機(jī)制及MSCs分化機(jī)制，以利增強(qiáng)MSCs的定向誘導(dǎo)分化及保障移植的安全性；其次，明確MSCs在受體內(nèi)存活、增殖及分化情況，必要時(shí)采用示蹤法觀察；第三，合理設(shè)計(jì)多中心隨機(jī)雙盲對(duì)照臨床研究驗(yàn)證療效，并了解移植可能發(fā)生的副作用或并發(fā)癥。隨著上述問(wèn)題的解決，MSCs移植應(yīng)用于臨床治療肝病將極具前景。

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