歐佐文 ，文 敏

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動科院，湖南長沙410128；2.湖南省韶山市世源獸藥廠，湖南 韶山411300）

豬大腸桿菌病是豬場中由致病性大腸桿菌引起，是危害仔豬生長發(fā)育的一種常見病和多發(fā)病。該病在仔豬的臨診表現(xiàn)也有不同，主要有黃痢型、白痢型和水腫型，仔豬黃痢尤為多見。其發(fā)病率已達(dá)到50%以上，死亡率超過56%。

隨著抗菌藥物的不斷應(yīng)用，細(xì)菌耐藥性的問題已非常嚴(yán)重，應(yīng)用常規(guī)藥物和常規(guī)方法防治豬大腸桿菌病的難度越來越大，大腸桿菌病已經(jīng)成為危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病之一。國內(nèi)外近年來對仔豬大腸桿菌病防治的相關(guān)研究，主要有:（1）研究新抗生素,；（2）應(yīng)用中藥進(jìn)行防治；（3）應(yīng)用益生菌進(jìn)行預(yù)防；（4）研究耐藥質(zhì)粒消除劑；（5）研制大腸桿菌疫苗；（6）研制抗體藥物；（7）利用外源抗體為仔豬提供被動免疫。從而預(yù)防和治療腸道病原性大腸桿菌感染。

其中，豬大腸桿菌卵黃抗體因其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、特異性抗體含量高、安全性好、易規(guī)?；a(chǎn)等特點(diǎn)越來越受到人們的注意，并有可能成為一種替代抗菌藥物的高效生物藥物。近年來國內(nèi)外的研究結(jié)果也證明，應(yīng)用卵黃抗體防治由致病性大腸桿菌引起的仔豬腹瀉，能夠取得比較滿意的效果。

1 卵黃抗體特性及作用機(jī)理

自Klemperer于1893年首次報(bào)道雞蛋中存在抗體并命名為卵黃抗體以來，人們對卵黃抗體的研究不斷深入。卵黃抗體中存在的免疫球蛋白以IgY為主，IgA和IgM的含量極低。通過對母雞進(jìn)行特異性免疫來生產(chǎn)卵黃抗體，比從經(jīng)特異性免疫的動物血液中獲得的抗體具有突出的優(yōu)點(diǎn)：（1）生產(chǎn)工藝簡單，從經(jīng)特異性免疫的動物采血不僅對動物本身造成嚴(yán)重應(yīng)激，從而影響產(chǎn)量，而且操作麻煩。收集特異性免疫雞蛋方便快捷，且可重復(fù)收?。唬?）生產(chǎn)成本低廉，每只免疫蛋雞可年產(chǎn)180～260枚蛋，每枚蛋中約含卵黃抗體90～210mg；（3）卵黃抗體較血清抗體穩(wěn)定性更好，卵黃抗體比血清抗體對酸、堿、熱更有耐受性，因而便利于運(yùn)輸及保存。預(yù)防仔豬大腸桿菌性腹瀉卵黃抗體對宿主特異性菌毛抗原有強(qiáng)烈的親和力，能在一定程度上降低宿主特異性菌毛與仔豬小腸上皮的結(jié)合，不利于致病性大腸桿菌在小腸黏膜定居增殖，阻斷了大腸桿菌產(chǎn)生腸毒素，從而減少甚至防止仔豬發(fā)生腹瀉。

2 預(yù)防仔豬大腸桿菌性腹瀉卵黃抗體對仔豬腹瀉的效果研究

盡管預(yù)防仔豬大腸桿菌性腹瀉卵黃抗體的生產(chǎn)工藝不同，其機(jī)理都是通過特異性的卵黃抗體來阻斷或降低大腸桿菌的宿主特異性菌毛與仔豬小腸上皮的結(jié)合，使其不能在消化道黏膜定居繁殖和產(chǎn)生腸毒素，從而防止腹瀉的發(fā)生。飼料中添加少量的卵黃抗體，可以顯著地降低仔豬腹瀉率，并在一定程度上提高動物的增重、飼料轉(zhuǎn)化率。

徐福洲等將致病性大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)壯、增殖、滅活而制備成大腸桿菌油乳劑苗,并應(yīng)用該疫苗按一定的免疫程序免疫，在蛋雞產(chǎn)蛋前一個月開始免疫，然后收集免疫雞蛋，提取卵黃抗體并大致純化后應(yīng)用于豬大腸桿菌病動物模型口服治療。試驗(yàn)表明，受治病豬腹瀉癥狀顯著減弱，與對照組差異明顯。試驗(yàn)組動物未出現(xiàn)死亡而對照組動物死亡率高達(dá)67%。

還有的學(xué)者并不用大腸桿菌全菌來制備疫苗，而是應(yīng)用分離純化的大腸桿菌菌毛蛋白制備成疫苗，將該疫苗多次接種蛋雞，并收取免疫雞蛋制備卵黃抗體。將卵黃抗體噴霧干燥后，應(yīng)用其對不同大腸桿菌菌株感染的腹瀉仔豬進(jìn)行治療。結(jié)果顯示，用間接ELISA效價(jià)為1∶625和1∶2500的卵黃抗體治療的兩組仔豬全部存活，而對照組仔豬的死亡率達(dá)到80%。Yutaka等應(yīng)用致病性大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的K99菌毛蛋白制備免疫原接種蛋雞后收取免疫雞蛋并制的卵黃抗體，當(dāng)稀釋至間接ELISA效價(jià)為1∶1600時，仍能夠有效治愈仔豬腹瀉，且能提高仔豬的日增重。Kim等曾分別以大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株K88菌毛和全菌制成疫苗接種蛋雞而制的卵黃抗體，并對兩種工藝所制的卵黃抗體的效價(jià)進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示前者的效價(jià)顯著高于后者。國內(nèi)學(xué)者也將由菌毛免疫和菌株免疫兩種不同工藝制備的卵黃抗體對豬大腸桿菌病的療效進(jìn)行了比較。肖馳等的試驗(yàn)顯示：兩類卵黃抗體都能有效地預(yù)防和治療仔豬大腸桿菌性腹瀉，但以菌毛K88制備疫苗免疫蛋雞制備的卵黃抗體對豬大腸桿菌病預(yù)防和治療效果更好。

另外，有的學(xué)者還用多種血清型的大腸桿菌制的多價(jià)菌苗接種蛋雞制備卵黃抗體，也顯示出較好的臨床應(yīng)用效果。李學(xué)伍等的試驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用多種血清型大腸桿菌制備多價(jià)大腸桿菌疫苗免疫蛋雞，從而制備出的卵黃抗體對腹瀉仔豬的治愈率最高可達(dá)97.7%，比抗菌藥物對腹瀉仔豬治療的治愈率高21.2%。不僅如此，在制備大腸桿菌多價(jià)苗選擇制苗菌株時，選用大腸桿菌地方株更優(yōu)于選用大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株。Marquardt等選用大腸桿菌地方株的菌毛抗原（K88+）接種蛋雞制備的卵黃抗體，對新生和斷奶感染致病性大腸桿菌的病豬不僅有較好的治療效果，而且對提前斷奶的仔豬感染致病性大腸桿菌也有較好的療效效。腹瀉的3日齡仔豬，在用卵黃抗體拌料飼喂后24h被治愈，而用未免疫豬大腸桿菌疫苗蛋雞的蛋黃粉拌料飼喂的對照組，仔豬腹瀉無任何好轉(zhuǎn)甚至更加嚴(yán)重，最后，對照組腹瀉仔豬不斷因嚴(yán)重腹瀉而死亡，死亡率達(dá)到62.5%。

3 應(yīng)用基因工程技術(shù)表達(dá)大腸桿菌菌毛抗原用以制備卵黃抗體的研究

在已有的公開報(bào)道中，致病性大腸桿菌菌毛抗原的基因已經(jīng)得到充分研究，完全可以利用基因工程技術(shù)來大規(guī)模生產(chǎn)致病性大腸桿菌菌毛抗原。這主要是由于原核表達(dá)中的工程菌（如大腸桿菌和酵母菌等）對目的基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制相對簡單和生長速度較快，因而可以快速超量合成在其它生物體內(nèi)含量極微但卻具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的生物活性物質(zhì)。

由于表達(dá)產(chǎn)物的提取純化技術(shù)的長足發(fā)展，應(yīng)用基因工程技術(shù)表達(dá)目標(biāo)抗原用以制備卵黃抗體的生產(chǎn)加工也已趨于工業(yè)化。如今，超過上百種生物活性蛋白抗原通過原核表達(dá)基因工程從而實(shí)現(xiàn)了對它們進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，如富含半胱氨酸殘基的血清白蛋白、尿激酶原和金屬硫蛋白等。Mooi FR等構(gòu)建成功含有K88ab抗原基因重組質(zhì)粒pFM205，轉(zhuǎn)化后獲得重組菌株能特異性地與抗K88ab的血清抗體結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物。洪孟民等成功研制出能超量表達(dá)致病性大腸桿菌K88基因的工程菌。國內(nèi)張景六等成功構(gòu)建攜帶K88、K99兩種菌毛抗原基因的雙表達(dá)載體，其表達(dá)產(chǎn)物可為預(yù)防不同血清型致病性大腸桿菌引起的仔豬腹瀉提供了廣譜的生物藥物制劑。吳雅旭等為了超量表達(dá)致病性大腸桿菌K88ac蛋白，應(yīng)用強(qiáng)啟動子構(gòu)建新型表達(dá)，轉(zhuǎn)化后獲得的新型K88ac抗原基因工程菌株對菌毛抗原表達(dá)效率為原K88ac抗原基因工程菌株的16倍。

隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，以及新啟動子的不斷創(chuàng)建和DNA重組載體系統(tǒng)研究的不斷深入，利用基因工程技術(shù)來構(gòu)建高效、穩(wěn)定的原核表達(dá)體系指日可待。構(gòu)建超量表達(dá)致病性大腸桿菌菌毛蛋白的載體，從而獲得超量表達(dá)致病性大腸桿菌菌毛蛋白的菌株，提高致病性大腸桿菌菌毛抗原的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)防治豬大腸桿菌性腹瀉卵黃抗體的免疫抗原的生產(chǎn)成本，從而大大降低卵黃抗體的生產(chǎn)成本，為這一替代抗菌藥物的新型飼料添加型生物藥物制劑在仔豬大腸桿菌性腹瀉防治中的廣泛應(yīng)用確立了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)。 □

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