魏愛民，杜勝利，韓毅科，張桂華，劉楠，崔興華

（天津科潤(rùn)公司黃瓜研究所，300192）

黃瓜是我國主要的蔬菜作物之一，是我國保護(hù)地栽培面積最大的蔬菜作物。黃瓜在生長(zhǎng)過程中極易遭受各種病蟲害及不利環(huán)境的影響，黃瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)大大降低。選育優(yōu)良品種是解決這些問題的關(guān)鍵，但由于現(xiàn)有種質(zhì)資源的限制，采用常規(guī)育種方法很難在一些性狀上有大的突破。隨著生物技術(shù)的發(fā)展及其在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，應(yīng)用基因工程技術(shù)有目的地改良性狀，特別是采用常規(guī)育種方法無法改良的性狀，創(chuàng)造黃瓜育種新種質(zhì)，為黃瓜育種技術(shù)的創(chuàng)新提供了新的途徑。

黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化研究始于1986年，經(jīng)過20多a的發(fā)展，研究者在黃瓜再生體系、轉(zhuǎn)化技術(shù)體系等方面進(jìn)行了大量研究，針對(duì)不同目的基因，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株及后代性狀進(jìn)行了詳細(xì)研究，相關(guān)研究報(bào)道較多。作者從黃瓜離體體細(xì)胞再生體系、轉(zhuǎn)化方法、目的基因等方面歸納整理了國內(nèi)外黃瓜轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展，并比較國外黃瓜轉(zhuǎn)基因狀況，分析了我國黃瓜轉(zhuǎn)基因研究中存在的問題，現(xiàn)綜述如下。

1 再生體系

高效、穩(wěn)定的再生體系是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的基礎(chǔ)。黃瓜離體體細(xì)胞再生研究始于1979年，根據(jù)再生芽產(chǎn)生方式的不同，黃瓜離體體細(xì)胞再生體系可分為以下兩種：器官發(fā)生途徑和胚狀體發(fā)生途徑。胚狀體發(fā)生途徑因?yàn)樵偕l率較低，較少采用；多數(shù)黃瓜離體體細(xì)胞再生體系均采用器官發(fā)生途徑。

基因型、激素種類及配比、外植體類型、苗齡、添加AgNO3等被認(rèn)為是影響黃瓜離體體細(xì)胞再生的關(guān)鍵因素[1，2]。侯愛菊等[3]比較了品種、外植體類型、不同激素配比等因素對(duì)黃瓜離體體細(xì)胞再生的影響，發(fā)現(xiàn)三者對(duì)于芽再生頻率均有顯著影響，最高每外植體出芽數(shù)可為13.2個(gè)。

2 轉(zhuǎn)化方法

早期的遺傳轉(zhuǎn)化是以發(fā)根農(nóng)桿菌為工程菌介導(dǎo)的。Trulson等[4]采用發(fā)根農(nóng)桿菌感染下胚軸，但由于毛狀根再生的頻率太低，只得到幾株再生植株。隨后施和平等[5]采用發(fā)根農(nóng)桿菌研究了黃瓜子葉外植體毛狀根再生的情況，除此之外，未見更多的使用發(fā)根農(nóng)桿菌對(duì)黃瓜進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的報(bào)道。

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，因轉(zhuǎn)化機(jī)理研究比較清楚，轉(zhuǎn)化效率相對(duì)較高，目前為多數(shù)研究者所采用，是進(jìn)行黃瓜轉(zhuǎn)基因研究的主要方法。

許多研究者[6，9]對(duì)影響黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系的因素進(jìn)行了研究，如農(nóng)桿菌菌株、質(zhì)粒載體的類型、細(xì)菌侵染濃度、感染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、乙酰丁香酮濃度及使用方法、抗生素種類及濃度、篩選標(biāo)記等，旨在建立成熟的轉(zhuǎn)化體系，將目的基因有效導(dǎo)入黃瓜。但這些轉(zhuǎn)化方法的外植體材料需要經(jīng)過嚴(yán)格的培養(yǎng)與再生過程才能獲得轉(zhuǎn)基因植株，步驟繁瑣，周期長(zhǎng)。因此，研究者也一直在探索避開組織培養(yǎng)的簡(jiǎn)單、有效的轉(zhuǎn)化途徑，如：電擊法、基因槍法、Floral dip方法、花粉管通道法等，。但這些方法雖操作簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)化率卻相對(duì)較低，轉(zhuǎn)化機(jī)理尚不清楚。

3 目的基因

主要針對(duì)與黃瓜抗病（真菌病害、病毒病）、抗蟲、抗逆、品質(zhì)、產(chǎn)量等相關(guān)性狀基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究。

3.1 抗病毒基因

病毒病是黃瓜主要病害之一。轉(zhuǎn)入病毒外殼蛋白編碼基因是抗病毒轉(zhuǎn)基因黃瓜研究中應(yīng)用較早和技術(shù)較為成熟的方法。利用病毒外殼蛋白編碼基因轉(zhuǎn)入植物，可以使病毒外殼蛋白在植物細(xì)胞中積累，能夠抑制侵染病毒的復(fù)制，從而減輕癥狀或推遲病毒發(fā)生的時(shí)間。 Chee等[12]、Nishibayashi等[13]將黃瓜花葉病毒外殼蛋白基因（CMV-CP）轉(zhuǎn)入黃瓜，轉(zhuǎn)基因植株抗性增強(qiáng)；王慧中等[14]將西瓜花葉病毒外殼蛋白基因（WMV-2CP）轉(zhuǎn)入黃瓜，轉(zhuǎn)基因植株可延遲發(fā)病時(shí)間，減輕發(fā)病程度。Gal-On等[15]將putative 54-kDa replicase gene轉(zhuǎn)入黃瓜，轉(zhuǎn)基因植株接 種 CFMMV （Cucumber fruit mottle mosaic tobamovirus）病毒，植株抗性達(dá)免疫程度，而且抗根部侵染。

3.2 幾丁質(zhì)酶基因

黃瓜在保護(hù)地栽培中極易受到真菌病害侵襲，嚴(yán)重影響黃瓜產(chǎn)量和品質(zhì)，如白粉病、枯萎病、灰霉病等。植物幾丁質(zhì)酶因能水解真菌細(xì)胞壁的主要成分幾丁質(zhì)，在抗植物真菌病害反應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用。來自日本的研究小組多年來深入研究了幾丁質(zhì)酶基因?qū)μ岣唿S瓜抗真菌病害的作用：Kishimoto等[16～17]將來源于水稻的 class I幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入黃瓜，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株葉表皮及葉肉內(nèi)幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)量上升，田間試驗(yàn)表明，植株抗灰霉病，抗疫霉病菌，但不抗枯萎病；Kishimoto等[18]又進(jìn)行class III幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化黃瓜研究，接種灰霉病病菌后發(fā)現(xiàn)，感染后4 d內(nèi)抗性明顯高于對(duì)照，但隨后發(fā)病。

3.3 甜蛋白基因

植物甜蛋白是從植物中發(fā)現(xiàn)的一類具有甜味的蛋白質(zhì)。植物甜蛋白具有許多優(yōu)點(diǎn)：甜度高，低熱量，無毒安全。甜蛋白（Thaumatin）提取自熱帶植物T.daniellii中，產(chǎn)量低，不能滿足市場(chǎng)需要，于是研究者開展了Thaumatin的基因工程研究，Thaumatin基因已被用來轉(zhuǎn)化了數(shù)種微生物、真菌和高等植物。

波蘭研究小組多年來一直進(jìn)行黃瓜Thaumatin基因轉(zhuǎn)化研究，用于黃瓜果實(shí)品質(zhì)改良：Malepszy等[19]將preprothaumatin II基因轉(zhuǎn)入黃瓜，發(fā)現(xiàn)preprothaumatin II在葉片、莖和果實(shí)中均有表達(dá)，果實(shí)有甜味，同時(shí)發(fā)現(xiàn)植株對(duì)霜霉病有抗性；Kiekiewicz等[20]田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)甜蛋白基因植株對(duì)蚜蟲、螨類、薊馬的吸引力明顯降低；Szwacka等[21]用35S啟動(dòng)子，將甜蛋白基因轉(zhuǎn)入黃瓜，并研究了甜蛋白在不同器官、不同時(shí)期的表達(dá)差異。

3.4 單性結(jié)實(shí)相關(guān)基因

提高栽培品種的單性結(jié)實(shí)能力，對(duì)于設(shè)施栽培條件下黃瓜正常結(jié)實(shí)，保證產(chǎn)量及商品性具有重要意義。由于果實(shí)發(fā)育與IAA直接相關(guān)，增加花芽中IAA水平，可促進(jìn)單性結(jié)實(shí)果實(shí)的發(fā)育和增加果實(shí)的產(chǎn)量。色氨酸單加氧酶（IAAM）是IAA生物合成中吲哚乙酰胺途徑的關(guān)鍵酶，其編碼基因iaaM已被克隆，利用iaaM轉(zhuǎn)化植株，已成功改良許多農(nóng)作物品種。目前應(yīng)用最多效果最好的是DefH9-iaaM嵌合基因，其中的iaaM基因編碼區(qū)分離自薩氏假單孢菌，它還包含了在子房中特異表達(dá)的DefH9啟動(dòng)子。Yin等[22]將DefH9-iaaM基因轉(zhuǎn)入黃瓜，轉(zhuǎn)基因株系中70%～90%可單性結(jié)實(shí)，且所結(jié)籽粒較小。蘇紹坤等[9]轉(zhuǎn)化iaaM基因，果實(shí)經(jīng)檢測(cè)80%為單性結(jié)實(shí)。生長(zhǎng)素結(jié)合蛋白（ABP1）為生長(zhǎng)素受體，將編碼該蛋白的基因轉(zhuǎn)入植物體，植物體內(nèi)生長(zhǎng)素結(jié)合蛋白含量提高，能促使植株對(duì)生長(zhǎng)素的敏感性增強(qiáng)。白吉?jiǎng)偟萚23]轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)素結(jié)合蛋白基因（ABP1）發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株果實(shí)單性結(jié)實(shí)能力明顯提高。

3.5 抗寒相關(guān)基因

研究發(fā)現(xiàn)植物中存在許多不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑，能夠使一些基因的表達(dá)被逆境脅迫誘導(dǎo)，從而對(duì)脅迫作出響應(yīng)，其中轉(zhuǎn)錄因子是參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑的蛋白質(zhì)。DREB類轉(zhuǎn)錄因子是AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)亞家族，能夠特異性地與抗逆基因啟動(dòng)子區(qū)域的DRE順式作用元件相結(jié)合，在低溫、干早和鹽堿等條件下調(diào)節(jié)一系列下游逆境應(yīng)答基因的表達(dá)，是逆境適應(yīng)中的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子。其中DREB1/CBF類成員已在擬南芥、小麥、煙草、油菜等作物中鑒定主要參與低溫脅迫應(yīng)答反應(yīng)。鄧小燕等[24]將轉(zhuǎn)錄因子CBF3轉(zhuǎn)入黃瓜，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。紀(jì)巍等[25]將受干旱、高鹽、低溫等脅迫信號(hào)誘導(dǎo)的rd29A啟動(dòng)子和組成性表達(dá)的35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的DREB1A基因轉(zhuǎn)入黃瓜中，分別獲得PCR檢測(cè)陽性株，而且觀察到rd29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)得到的植株性狀表現(xiàn)更好。

3.6 花器官發(fā)育相關(guān)基因

黃瓜雌花節(jié)位的高低是影響產(chǎn)量的主要因素，選育強(qiáng)雌或全雌性品種是目前黃瓜育種的主要目標(biāo)之一，同時(shí)研究黃瓜花發(fā)育的分子機(jī)制具有重要的理論意義。乙烯可強(qiáng)化高等植物的雌性表達(dá)，ACC合酶（ACS）是乙烯生物合成過程中的關(guān)鍵酶，研究表明ACS基因可能與F基因（控制雌性表達(dá)）有關(guān)。李泠等[26]將從黃瓜中克隆到的ACC合酶（ACS1）基因轉(zhuǎn)入黃瓜，獲得轉(zhuǎn)基因植株，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的性型表現(xiàn)較復(fù)雜。MADS-box是調(diào)控黃瓜性別發(fā)育的另一類基因家族，已經(jīng)從黃瓜中分離得到很多MADS-box基因，它們與器官的成熟早晚、產(chǎn)量及品質(zhì)密切相關(guān)。賴來等[27]報(bào)道了將從黃瓜中克隆到的MADS-box同源基因CSMADS06，轉(zhuǎn)化到不同品系的黃瓜S06和S52中，可獲得抗性植株。

3.7 抗除草劑基因

抗除草劑基因在植物遺傳轉(zhuǎn)化中多用作選擇標(biāo)記，同時(shí)又可用來做轉(zhuǎn)化的目的基因。金紅等[28]將除草劑bar基因轉(zhuǎn)入黃瓜，同時(shí)利用轉(zhuǎn)基因純合株系為父本與非轉(zhuǎn)基因母本雜交，對(duì)其后代進(jìn)行雜交種純度鑒定，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株及雜交組合后代進(jìn)行除草劑噴霧，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株84%表現(xiàn)較高抗性，雜種純度鑒定準(zhǔn)確率達(dá)100%。

3.8 抗蟲基因

黃瓜栽培中因蚜蟲、茶黃螨、白粉虱等的為害，時(shí)常造成減產(chǎn)等重大損失，而且因害蟲防治還會(huì)引發(fā)農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等一系列問題，選育抗蟲黃瓜新品種是持續(xù)控制害蟲的根本措施。張文珠等[29]將復(fù)合結(jié)構(gòu)域蛋白酶抑制劑基因，轉(zhuǎn)入黃瓜，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。

3.9 功能食品相關(guān)基因

促胰島素基因：王翠艷等[30]將GAD-GLP-1和多拷貝長(zhǎng)效GLP-1基因，成功轉(zhuǎn)入黃瓜，并完成分子及藥效檢測(cè)，有望進(jìn)一步結(jié)合常規(guī)育種培育食用功能型黃瓜預(yù)防和治療糖尿病?？顾ダ匣颍篖ee等[31]轉(zhuǎn)化木薯的超氧化物歧化酶基因（Superoxidedismutase，SOD），期望利用黃瓜作為生物反應(yīng)器，產(chǎn)生抗衰老的SOD，SOD活性檢測(cè)表明從轉(zhuǎn)基因植株上收獲的黃瓜果實(shí)中的SOD活性是未轉(zhuǎn)基因黃瓜的3倍。

4 黃瓜轉(zhuǎn)基因植株安全性評(píng)價(jià)

轉(zhuǎn)基因食品的安全性一直為社會(huì)所關(guān)注，主要包括食用安全與環(huán)境安全。黃瓜作為加工與鮮食為主的蔬菜，轉(zhuǎn)基因植株及果實(shí)的安全性更為研究者所重視。研究者Koga-Ban等[32]將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入黃瓜，獲得抗灰霉病轉(zhuǎn)基因黃瓜，分別從以下幾方面進(jìn)行安全性研究：①植株和果實(shí)的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)；②育性；③對(duì)環(huán)境產(chǎn)生可能的為害性；④土壤微生物群落的影響；⑤農(nóng)桿菌殘留。結(jié)果表明除了幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)和灰霉病抗性表達(dá)外，發(fā)現(xiàn)與非轉(zhuǎn)基因植株無差異。

5 問題與對(duì)策

研究者對(duì)黃瓜轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)行了多年堅(jiān)持不懈的努力，取得了很多進(jìn)展。但依然存在以下問題。

①黃瓜農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化效率較低，如要獲得育種應(yīng)用的優(yōu)良株系，需要進(jìn)行大量外植體的轉(zhuǎn)化工作，工作量較大。因此仍需進(jìn)一步完善提高黃瓜農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，同時(shí)探索適宜黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化應(yīng)用的新方法。

②目的基因分散，對(duì)比上述有關(guān)國內(nèi)、國際黃瓜轉(zhuǎn)基因研究?jī)?nèi)容可見，波蘭和日本研究團(tuán)隊(duì)多年來圍繞幾丁質(zhì)酶基因和甜蛋白基因開展了持續(xù)有效的工作，而國內(nèi)則從多方面進(jìn)行了探索性研究，圍繞一個(gè)目標(biāo)進(jìn)行持續(xù)研究的少。因此在今后的研究中應(yīng)找準(zhǔn)切入點(diǎn)，進(jìn)行深入而持續(xù)的研究。

③篩選標(biāo)記問題，幾乎所有的植物遺傳轉(zhuǎn)化中都要使用選擇性標(biāo)記基因，如抗生素或除草劑抗性基因等來篩選轉(zhuǎn)化子，由此而引起公眾的安全性顧慮以及環(huán)境釋放的安全性問題也要考慮。因此，研究者已陸續(xù)在開展一種全新的發(fā)展策略即獲取無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物，這種新策略（無標(biāo)記）有著巨大的應(yīng)用潛力。

伴隨轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展和成熟，相信轉(zhuǎn)基因植株的安全性問題將會(huì)得到良好的解決，另外，消費(fèi)者、生產(chǎn)者及管理機(jī)構(gòu)將更能接受轉(zhuǎn)基因食品，轉(zhuǎn)基因技術(shù)將在黃瓜育種中發(fā)揮更重要的作用。

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