史同瑞,黃宇翔,蘇永福

(黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所,黑龍江齊齊哈爾 161006)

當(dāng)禽體受到特定抗原的刺激后,會產(chǎn)生相應(yīng)的特異性免疫抗體,其中,機體產(chǎn)生的IgY抗體會從血液中大量主動轉(zhuǎn)運至卵黃中,這種貯存于卵黃中的抗體稱為卵黃免疫球蛋白(yolk immunoglobu lin,IgY),亦稱卵黃抗體(yolk antibody)[1]。自1893年K lem perer等首次報道雞蛋中存在抗體以來,現(xiàn)已就卵黃抗體的形成、結(jié)構(gòu)特性、制備與提取方法,以及在疾病診治中的應(yīng)用等方面進行了較為深入的研究,并取得了顯著的成果[2]。目前,有關(guān)卵黃抗體的研究已成為一個非常熱門的研究領(lǐng)域,現(xiàn)有研究已經(jīng)證實,卵黃抗體是一種新型、高效的綠色制劑,對診斷、預(yù)防和治療細菌和病毒引起的疾病具有良好的作用。本文就卵黃抗體的形成、結(jié)構(gòu)特點、理化和生物學(xué)特性及其作用機理作一綜述。

1 卵黃抗體形成

禽類的免疫系統(tǒng)包括細胞免疫和體液免疫兩部分,并分別受胸腺和法氏囊的控制。禽體內(nèi)主要存在3種免疫球蛋白,即IgG、IgM 和 IgA,其中 IgG是禽的主要免疫球蛋白。研究表明,由于禽IgG的特性與哺乳動物的IgG存在著許多差異,因而通常將禽IgG稱作IgY[3]。

在家禽受到外源抗原的刺激后,外源抗原能夠刺激法氏囊的B淋巴細胞分化形成漿細胞,并分泌特異性抗體進入機體血液循環(huán)。當(dāng)血液流經(jīng)卵巢時,由于卵黃膜表面存在著密集的免疫球蛋白受體,所以流經(jīng)輸卵管血液中的特異性抗體,其中主要是IgY,便與卵黃膜上的受體結(jié)合,然后通過主動運輸從血液中大量轉(zhuǎn)運至卵黃中,并在卵黃中大量蓄積,形成卵黃抗體,卵黃抗體的轉(zhuǎn)運量與血清中的IgY濃度有關(guān)。當(dāng)卵細胞運行至輸卵管時,流經(jīng)輸卵管血液中的特異性抗體,主要是IgM和IgA,進入卵清中,形成卵清抗體。與卵黃抗體相比,由于卵泡在輸卵管中移行時間較短,同時加之生理特性等原因,因而蛋清中的抗體含量極微,且蛋清中的免疫球蛋白主要是IgM 和IgA[1-2,4]。在禽胚孵化過程中,卵黃抗體逐漸進入禽胚血液中,為新生雛提供被動性免疫保護,在雛禽疾病預(yù)防中具有重要作用。

2 IgY結(jié)構(gòu)特點

禽IgY的結(jié)構(gòu)與哺乳動物的IgG相似,均具有典型的空間構(gòu)象,均能與抗原相結(jié)合,然而在某些方面禽IgY與哺乳動物IgG也存在差異。禽IgY也是由兩條輕鏈(2L)和兩條重鏈(2H)組成,分子質(zhì)量一般比哺乳動物的IgG大,為180 ku。每條輕鏈的分子質(zhì)量為22 ku～30 ku,較哺乳動物IgG的30 ku小,每條重鏈的分子質(zhì)量為65 ku～70 ku,較哺乳動物的50 ku大。哺乳動物IgG的重鏈(γ)由1個可變區(qū)(VH)和3個恒定區(qū)(Cγ1～Cγ3)組成,Cγ1與Cγ3之間為絞鏈區(qū),此區(qū)賦予Fab片段較大的靈活性,而禽IgY重鏈(υ)除 1個可變區(qū)外,還有 4個恒定區(qū) ,即 Cυ1～ Cυ4,無鉸鏈區(qū)[3,5-6]。

禽IgY的沉淀系數(shù)為7 S,等電點為5.2,含氮量為14.8%。研究表明,禽IgY的疏水基團多于哺乳動物的IgG,比較IgG和IgY的C-端序列發(fā)現(xiàn),在基因序列上,IgG的Cγ2區(qū)和Cγ3區(qū)分別與IgY的Cυ3區(qū)和Cυ4區(qū)相似,而哺乳動物的IgG缺失類似禽IgY的Cυ2區(qū),取而代之的是絞鏈區(qū)。序列比較分析同樣發(fā)現(xiàn),相對于其他免疫球蛋白IgA、IgM和IgD而言,禽IgY與哺乳動物的IgE在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)上更接近一些[7-9]。

3 IgY理化性質(zhì)

禽IgY與哺乳動物的IgG相比,由于存在結(jié)構(gòu)的差異,所以穩(wěn)定性較好,具有耐熱、耐酸、耐堿和一定的抗酶降解能力。禽IgY具有良好的耐熱能力,能夠耐受巴氏消毒,在溫度達到65℃時,IgY的活性可保持24 h以上,70℃加熱90min后活性下降。IgY的穩(wěn)定性比兔血清IgG稍低,IgY的變性溫度是73.9℃,兔血清為77℃。在溫度低于75℃條件下,IgY具有良好的熱穩(wěn)定性,如在4℃環(huán)境貯存5年,或在室溫貯存半年,或在37℃環(huán)境貯存1個月,IgY活性基本無明顯改變。將IgY溶解于生理鹽水中,在4℃環(huán)境貯存6年～7年,其抗體活性降低不超過5%[10-11]。

禽IgY具有耐高滲性能和良好的耐反復(fù)凍融特性,在60%高濃度蔗糖溶液中仍有活性。IgY耐酸堿性較好,在pH 4.0～11.0范圍內(nèi)比較穩(wěn)定,在pH 3.0～3.5范圍時活性迅速下降,在pH 12.0時活性有所下降。經(jīng)1∶20稀釋的IgY與1mol/L鹽酸作用30 min,其活性降低50%,作用 60 min活性才完全消失。禽IgY對胃蛋白酶有較強的抵抗力,但對胰蛋白酶較為敏感。在pH 2.0條件下,將胃蛋白酶與IgY混合溫育1 h,活性基本喪失,但在pH 4.0條件下溫育1 h,可保持91%的活性,溫育10 h后仍可保持63%的活性。將IgY分別與胰蛋白酶和胰凝乳酶溫育8 h,活性分別保持39%和41%。在pH 4.0左右的胃內(nèi)酸性條件下,IgY滯留4 h后,其活性降至50%左右[7-8,12]。

禽IgY生物學(xué)特性獨特,IgY與相應(yīng)抗原形成的免疫復(fù)合物不能激活哺乳動物的補體系統(tǒng),不與哺乳動物細胞的Fc受體、人抗鼠抗體、葡萄球菌蛋白A(SPA)和葡萄球菌蛋白G(SPG)結(jié)合,也不能與哺乳動物的類風(fēng)濕因子(RF)發(fā)生反應(yīng)[2,13]。

4 IgY作用機理

卵黃抗體預(yù)防和治療疾病的過程是免疫反應(yīng)的過程,其作用機理主要是IgY與病原的特定黏附因子發(fā)生特異性結(jié)合,從而導(dǎo)致病原喪失致病性。IgY能夠黏附在特定病原的細胞壁上,改變病原的完整性,抑制病原的生長;IgY也能黏附在特定病原菌的菌毛上,排斥細菌黏附于腸道黏膜的上皮細胞,抑制病原菌的定殖[14]。大腸埃希菌、沙門菌等病原首先需要黏附于動物腸道黏膜細胞上,才能增殖,產(chǎn)生毒素,并感染動物。研究證實,抗大腸埃希菌卵黃抗體防治仔豬腹瀉的作用機理有兩種:一是卵黃抗體與大腸埃希菌的黏附因子結(jié)合,阻止大腸埃希菌黏附于小腸黏膜;二是卵黃抗體可直接與小腸黏膜的受體結(jié)合,阻止了大腸埃希菌黏附因子與小腸黏膜的結(jié)合[15]。用分離提純的特異性菌毛抗原,制備抗產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌卵黃抗體,體外黏附試驗表明,效價為1∶640和1∶1 280的卵黃抗體顯著抑制了K 88ae對腸上皮細胞的黏附作用,平均每個上皮細胞分別黏附8.5和2.4個細菌,而空白對照組平均每個上皮細胞黏附l6.4個K 88ae,二者差異極顯著[14]。

口服卵黃抗體時,部分卵黃抗體在腸道消化酶的作用下,能夠降解為可結(jié)合的片段,這些片段含有抗體的可變小肽(Fab)部分,小肽很易被腸道吸收,進入血液循環(huán),并能與特定的病原黏附因子結(jié)合,使病原不能黏附于易感細胞而失去致病性。這些小肽還能與宿主血液中的球蛋白末端相結(jié)合,使其免遭機體破壞。IgY在腸道降解后形成的IgY穩(wěn)定區(qū)(Fe)則存留在腸道內(nèi)發(fā)揮作用[2,16-17]。

5 卵黃抗體的優(yōu)點

5.1 產(chǎn)量高,成本低,易于生產(chǎn)

卵黃抗體來源于禽蛋,家禽易于飼養(yǎng)管理,產(chǎn)蛋多,費用適宜,飼養(yǎng)不受地域和季節(jié)的限制,這均為制備大量的卵黃抗體提供了經(jīng)濟、豐富的來源。與從動物血液中提取抗體的傳統(tǒng)方法比較,從卵黃中提取IgY更為便捷,對動物也無損傷,簡便易行。試驗證實,卵黃中免疫球蛋白的含量一般為3mg/mL～25 mg/mL,一只商品蛋雞年產(chǎn)蛋大約300枚,每枚蛋蛋黃大約為15 mL,每只雞每年能提供大約15 g～100 g的IgY抗體[5,18]。研究結(jié)果表明,不同品系母雞所產(chǎn)蛋的IgY含量也不相同,這就意味著有可能通過遺傳選育高產(chǎn)品系雞來提高IgY產(chǎn)量[4-5]。

由于禽類與哺乳動物種系差距大,當(dāng)用禽生產(chǎn)抗哺乳動物組織成分的抗體時,可以用較少的抗原,產(chǎn)生較多的抗體,且免疫家禽卵黃中的IgY滴度能長時間維持較高水平,因此,禽類更適于用來生產(chǎn)抵抗哺乳動物病毒和細菌性疾病的特異性卵黃抗體。卵黃抗體的制備與提取方法較為簡便,純化的抗原經(jīng)口服、注射等途徑強化免疫家禽,待卵黃抗體達到理想效價后收集卵黃,經(jīng)提取后即可得到粗制IgY。卵黃抗體能制成液體、粉劑等劑型產(chǎn)品,制備方法簡單,成本低,可規(guī)?；a(chǎn)[19]。

5.2 作為診斷試劑,具有較高的敏感性

抗原與免疫動物的親緣關(guān)系越遠,越易被機體識別,產(chǎn)生的免疫應(yīng)答反應(yīng)也越強。由于禽類與哺乳動物的親緣關(guān)系甚遠,所以哺乳動物的蛋白質(zhì)抗原在禽體內(nèi)更易產(chǎn)生特異性較強的免疫抗體,與IgG比較,IgY能夠識別更多哺乳動物蛋白的抗原表位。許多高度保守的抗原,雖在哺乳動物中僅產(chǎn)生微弱的免疫原性,但也可用IgY進行區(qū)分,因此,IgY可應(yīng)用于更多哺乳動物疾病的監(jiān)測和診斷中[10]。

禽IgY獨特的生物學(xué)特性,決定其在免疫檢測中具有很大的應(yīng)用潛力。在檢測試驗中,補體系統(tǒng)激活后,能影響抗原與特異性抗體的結(jié)合,導(dǎo)致產(chǎn)生假陰性結(jié)果,從而影響免疫檢測的準確性。與哺乳動物IgG不同,IgY不能激活哺乳動物的補體系統(tǒng),因此可提高診斷方法的準確性。在ELISA試驗中,如用IgG包被微量檢測板,哺乳動物血清中被活化的補體可與抗體結(jié)合,從而抑制了特異性抗原與抗體的結(jié)合,而采用IgY包被檢測板作為捕獲抗體,就不會激活標本中的補體系統(tǒng),避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果[9,20-22]。此外,與IgG相反,由于IgY不與哺乳動物的類風(fēng)濕因子(RF)結(jié)合,同時也不能與哺乳動物Fc受體、葡萄球菌蛋白A(SPA)、葡萄球菌蛋白G(SPG)發(fā)生非特異性反應(yīng),因此,使用IgY可以避免由抗哺乳動物IgG抗體引起的干擾作用,不能導(dǎo)致假陽性結(jié)果的產(chǎn)生,IgY作為診斷試劑特異性更強,靈敏度更高[7,23-24]。如因糞便中的SPA和SPG含量很高,所以IgG不能用于檢測糞便樣本,而用IgY則不受影響。然而IgY與IgG相比,在結(jié)構(gòu)上不易發(fā)生改變,也就不能有效地凝集抗原,因此,為了達到與IgG同樣的凝集效果,則需要較多的IgY,而這會增加試驗的成本[5]。

5.3 療效高,無毒副作用

卵黃抗體具有較高的免疫活性。作為預(yù)防和治療藥物,可直接與相應(yīng)的抗原發(fā)生快速免疫反應(yīng),具有作用迅速、療效確切等優(yōu)點。卵黃抗體治療疾病是一種免疫學(xué)反應(yīng)過程,抑殺病原具有特異性,不會產(chǎn)生耐藥菌,避免了使用抗生素殺死有益微生物,導(dǎo)致機體微生態(tài)失調(diào),產(chǎn)生耐藥菌株,引起繼發(fā)感染的副作用。卵黃抗體是禽蛋中存在的一種天然蛋白質(zhì),發(fā)揮作用后即可被機體作為營養(yǎng)物質(zhì)分解利用,無副作用,不會殘留有害物質(zhì)[17,25-26]。

5.4 性質(zhì)穩(wěn)定,便于保存和使用

卵黃抗體作為一種具有生物活性的免疫球蛋白,在貯存、生產(chǎn)、加工和應(yīng)用過程中,保證其穩(wěn)定性是非常關(guān)鍵的。研究證實,卵黃抗體具有理想的穩(wěn)定性,能夠耐熱、耐酸、耐堿和一定的抗酶降解能力。試驗表明,用人工胃液消化卵黃抗體,在胃液含量較少的情況下,卵黃抗體效價基本無變化,雖然胃液含量高時影響較大,但在動物體內(nèi),胃液與食物的比例一般不超過1∶3,因此,實際應(yīng)用時,胃液對卵黃抗體效價的影響并不大。由于卵黃抗體對胃蛋白酶具有一定的抵抗力,因此,既可經(jīng)口服途徑使用,也可經(jīng)肌內(nèi)注射使用。卵黃抗體耐熱性能良好,可制成粉劑、液體制劑、凍干品等劑型,從而易于制劑的保存和運輸[9]。

卵黃免疫球蛋白是一種來源豐富、性質(zhì)穩(wěn)定的多克隆抗體,具有穩(wěn)定、安全、高效、無毒副作用等優(yōu)點,是診斷和防治疾病的理想制劑。隨著人們對卵黃抗體認識和研究的不斷深入,卵黃抗體將具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。

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