李志勇,孫啟忠,李鴻雁,王小麗,2,師文貴,戴 軍

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所,農(nóng)業(yè)部沙爾沁牧草資源重點野外科學(xué)觀測試驗站,內(nèi)蒙古呼和浩特 010010;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室,中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,甘肅蘭州 730070;3.內(nèi)蒙古烏蘭察布市察右中旗扶貧辦公室,內(nèi)蒙古烏蘭察布 013461)

牧草種質(zhì)資源是指所有牧草物種及其可遺傳物質(zhì)的總和。他是牧草及農(nóng)作物改良所用的原始材料,是農(nóng)業(yè)自然資源的重要組成部分,在草地畜牧業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著巨大不可忽視的作用[1]。我國的草地面積約4億hm2,占我國陸地總面積的41.7%,是農(nóng)田面積的近4倍[2]。我國是世界上牧草種質(zhì)資源最豐富的國家之一,蘊藏著豐富的遺傳基因,為了充分開拓利用豐富多樣的優(yōu)異種質(zhì)資源,就必須把不同的個體加以區(qū)別。目前,最可靠的方法是分子標記[3,4]。分子標記是以生物大分子的多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標記,其直接反映水平上的個體差異。他的產(chǎn)生突破了遺傳學(xué)研究的瓶頸,克服了傳統(tǒng)的形態(tài)標記、細胞學(xué)標記和生化標記易受外界因素、生物個體發(fā)育階段及器官組織差異影響的缺陷,具有不可比擬的優(yōu)勢,因而具有廣泛的應(yīng)用前景[5]。

1 分子標記的類型和特點

1.1 RFLP分子標記

常見的分子標記技術(shù)主要有 RFLP、RAPD、AFLP 、SSR、ISSR等。

RFLP標記(限制片段長度多態(tài),RFLP)作為遺傳工具由Grozdicker在1974年創(chuàng)立,是最早發(fā)展的分子標記。基本原理是:不同材料的DNA用已知的限制性內(nèi)切酶消化后,產(chǎn)生許多大小不等的DNA片段,經(jīng)電泳分離、Southern印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上,用放射性標記的探針與膜上變性的酶切DNA進行雜交,放射自顯影,顯示出不同材料的多態(tài)性圖譜,即顯示出所分析的DNA序列間的 RFLP。RFLP標記呈孟德爾式遺傳,大多數(shù)RFLP的等位基因為共顯性;廣泛存在于生物體內(nèi);在任何分離群體中可區(qū)分純合基因型與雜合基因型;在非等位的RFLP標記之間不存在上位互作效應(yīng);結(jié)果穩(wěn)定重復(fù)性好,標記的數(shù)目多且穩(wěn)定[6]。這些優(yōu)點使RFLP標記適用于構(gòu)建高密度的遺傳圖譜,基因標記定位,分析群體內(nèi)和群體間遺傳變異度、群體間基因流評價和親緣關(guān)系等方面。盡管該技術(shù)有上述諸多優(yōu)點,但也有其局限性:對DNA的量及純度要求高;實驗操作復(fù)雜,成本高,效率低,而且探針具有種屬特異性;大多數(shù)RFLP多態(tài)位點信息量低,其多態(tài)性過分依賴限制性內(nèi)切酶的選用[7]。

1.2 RAPD分子標記

RAPD(隨機擴增多態(tài)DNA)是1990年由美國杜邦公司的Williams和加里福尼亞生物研究所的Welsh同時發(fā)展起來的一種分子遺傳標記技術(shù),是建立在PCR基礎(chǔ)上的一種DNA分子標記技術(shù)[8]。RAPD技術(shù)就是以人工合成的隨機核苷酸序列為引物(通常為9～10個 bp),以基因組總DNA為模板,利用PCR技術(shù)隨機擴增得到一系列的多態(tài)性DNA片段,然后電泳檢測其多態(tài)性。RAPD技術(shù)的優(yōu)點是:不需要DNA探針;使用隨機引物,合成引物時無需預(yù)知被研究材料的基因組序列,一套引物可用于不同植物的研究;RAPD技術(shù)操作簡便、快速,可免去RFLP中的克隆制備、同位素標記、Southern雜交等步驟;RAPD分析所需DNA量少,每個反應(yīng)僅需幾十納克的DNA;不受環(huán)境、發(fā)育、數(shù)量性狀遺傳等的影響。因此,RAPD技術(shù)適用于種質(zhì)資源的鑒定和分類、目標性狀基因分子標記、遺傳圖譜的快速構(gòu)建等研究,在植物種質(zhì)資源研究利用上得到了廣泛應(yīng)用[9]。但RAPD也存在著一些實際困難:RAPD檢測的多數(shù)位點標記帶為顯性特點,不能提供完整的遺傳信息;用于二倍體生物時,區(qū)別純合子和雜合子會有難度;RAPD的再現(xiàn)性(穩(wěn)定性,重復(fù)性)差;存在共遷移問題。

1.3 AFLP分子標記

AFLP(擴增片段長度多態(tài))是由Zabeau 1992年發(fā)明的一項新的DNA分子標記技術(shù),該標記技術(shù)的出現(xiàn)是DNA指紋技術(shù)的重大突破。AFLP是在PCR和RFLP的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種檢測DNA多態(tài)性的新方法,其結(jié)合了RFLP和RAPD技術(shù)的優(yōu)點,并于1993年獲得歐洲專利局專利[10]。其基本原理是通過對基因組DNA酶切片段的選擇性擴增來檢測DNA酶切片段長度的多態(tài)性。先用限制性內(nèi)切酶消化切割染色體DNA,產(chǎn)生大量不同大小的DNA片段,然后采用PCR技術(shù)將這些片段擴增。由于不同材料的DNA酶切片段存在差異,因而就產(chǎn)生了擴增產(chǎn)物的多態(tài)性。

近年來AFLP技術(shù)在品種指紋圖譜的繪制,遺傳連鎖圖的構(gòu)建及遺傳多樣性的研究得到了廣泛的應(yīng)用[11]。AFLP技術(shù)也存在一些缺點:不是全共顯性標記,條帶統(tǒng)計分析難度較大;對DNA的純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求較高,技術(shù)要求高;AFLP技術(shù)試劑盒昂貴,成本較高相對費時[12,13];擴增時有假陽性結(jié)果和假陰性結(jié)果出現(xiàn),凝膠背景雜亂。

1.4 SSR分子標記

在真核生物基因組中,散在分布著由1-6bp組成的簡單重復(fù)序列,即簡單序列重復(fù)(simple sequence repeat,SSR),又稱為微衛(wèi)星 DNA(micro-sateuite DNA)。不同品種或個體核心序列的重復(fù)次數(shù)不同,但重復(fù)序列兩側(cè)的DNA序列是保守的,利用與核心序列互補的引物,通過PCR擴增和電泳可分析不同基因型個體在每個SSR位點上的多態(tài)性,即為SSR技術(shù)[14]。

SSR技術(shù)的優(yōu)點是(1)檢測的多態(tài)性頻率高、重復(fù)性好、共顯性、在基因組中隨機分布,標記數(shù)量多;(2)實驗重復(fù)性好,結(jié)果可靠性高,操作簡單;(3)該標記所需DNA量少,僅需微量組織,即便其降解,亦能有效地分析鑒定。在基因組研究中作為一種主要的分子標記技術(shù),已廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜的構(gòu)建、比較基因組研究、遺傳多樣性分析和系統(tǒng)學(xué)研究。但是,SSR需要測序和設(shè)計引物,因而需要大量的人力、物力和時間,另外,其種屬特異性強,開發(fā)所需的費用高昂[15]。

1.5 ISSR分子標記

ISSR(簡單重復(fù)序列間區(qū),ISSR)是以重復(fù)序列的單一引物為主要引物序列的PCR標記,由加拿大蒙特利爾大學(xué)的Zietkiewicz等1994年提出。優(yōu)點是遺傳多態(tài)性高、重復(fù)性好、顯性標記、耗資少、模板用量少等[16,17]。不足之處在于PCR擴增反應(yīng)的最適條件需要一定時間摸索;ISSR標記大多是顯性標記,在解決交配系統(tǒng)計算雜合度與父系分析等問題時效果不佳。

2 在牧草種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用

2.1 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建和基因定位

遺傳連鎖圖譜(genetic linkage map)指通過遺傳重組分析得到的基因或?qū)Ｒ坏亩鄳B(tài)性遺傳標記在染色體上線性排列順序圖,其間的距離通常用遺傳重組值來表示。遺傳圖譜是植物遺傳研究的重要內(nèi)容,又是種質(zhì)資源、育種及基因克隆等許多應(yīng)用研究的理論依據(jù)和基礎(chǔ)。遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建步驟包括:(1)依據(jù)研究對象、目標和現(xiàn)有條件選擇所用遺傳標記;(2)確定親本組合,構(gòu)建作圖群體;(3)分析構(gòu)圖群體中植株的標記基因型;(4)標記間連鎖群和標記位點的確定[18]。分子標記是構(gòu)建高飽和度連鎖圖的有力工具,利用分子標記能進行圖譜基因克隆生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物;在遺傳圖譜的基礎(chǔ)上進行數(shù)量性狀基因的定位(QTL)、標記(t-agging)、為分子輔助選擇(molecular-assisted/aided selection,MAS)提供高效的標記;遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建為利用分子標記技術(shù)進行基因定位奠定了堅實的基礎(chǔ),而進一步的比較基因組圖譜在植物基因組學(xué)和進化研究中具有重要的作用[19]。

國內(nèi)外科學(xué)家現(xiàn)已定位了水稻、大豆、小麥、玉米等作物的基因,牧草和草坪草的基因定位研究相對較少。目前,已構(gòu)建了20多張牧草和草坪草遺傳連鎖圖[20],主要有紫花苜蓿(Medicago sativa)、黑麥草(Lolium spp.)、羊茅(Festuca spp.)、結(jié)縷草(Zopsia spp.)和百脈根(Lotus spp.)、三葉草(Tri folium repens)等常用草種。百喜草(Paspalum spp.)、賴草(Leymus spp.)、高丹草(Sorg-hum ×Sudan grass)等也有研究報道。

Xu等基于RFLP分子標記構(gòu)建了世界上第一張六倍體高羊茅(Festuea arundinacea)的遺傳圖譜[21]。Brummer等采用RFLP標記構(gòu)建了紫花苜蓿(Medicago sativa)108個標記數(shù)的遺傳連鎖圖譜[22]。Barcaccia等應(yīng)用AFLP,RAPD和RFLP對紫花苜蓿進行遺傳連鎖分析,構(gòu)建了67個標記的圖譜[23]。Mccoy等在抗寒抗病性強的同源四倍體苜蓿(Mdzhawakhetica)中發(fā)現(xiàn)了70個RAPD標記和l5個RFLP標記[24]。Albertini等利用AFLP與RAPD技術(shù)構(gòu)建了包括55個位點的完整的紫花苜?；蜻B鎖圖譜,并發(fā)現(xiàn)了1個與紫花苜蓿未減半配子產(chǎn)生有關(guān)的特別的AFLP標記[25]。Julier等利用7對引物,獲得了 186個顯性AFLP標記,繪制了四倍體紫花苜蓿親本及雜交后代遺傳圖譜[26]。Isobe等構(gòu)建了三葉草的第一張基于cDNA探針的RFLP遺傳圖譜[27]。逮曉萍等以高丹草(Sorghum ×Sudan grass)(314A ×ZKSD)的 F2∶3家系作為構(gòu)圖群體,構(gòu)建了包含158個AFLP、8個RAPD標記的高丹草AFLP和RAPD遺傳連鎖圖,覆蓋高丹草基因組 836cM,標記間平均間距為 5.03 cM[28]。丁成龍等采用 SSR、AFLP、EST-CAPS和RGA-CAPS等標記方法利用對多花黑麥草細胞質(zhì)雄性不育(CMS)F1群體進行了遺傳連鎖圖的構(gòu)建[29]。Bouton等定位了苜蓿耐鋁數(shù)量性狀位點(QTL)[30]。Sledge等用2種 RFLPs標記對雙倍體苜蓿進行RFLP分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)有2個與耐受有毒的酸性鋁相關(guān)的基因,并將其定位在苜蓿RFLP圖譜上[31]。在苜蓿染色體上有4個位點與耐鋁有關(guān),其中一個位點起主效作用[30-32]。Petrusa等在苜蓿cDNA文庫中分離出PUM90-1,PUM90-2和PUM91-4三個脫落酸誘導(dǎo)基因,這3個基因都與鹽脅迫有關(guān)[33]。遺傳圖譜的繪制使牧草遺傳研究取得了重大進展,并對未來的分子標記育種將產(chǎn)生巨大的推動作用。

2.2 遺傳多樣性與親緣關(guān)系分析

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分,遺傳多樣性水平的度量和保護已成為生物多樣性研究的核心問題。分子標記是統(tǒng)計遺傳多樣性水平的有效工具,可以確定親本之間的遺傳差異和親緣關(guān)系,從而確定親本間的遺傳距離并進而劃分雜交優(yōu)勢,提高雜種優(yōu)勢潛力,利用DNA多樣性可以計算種群間的遺傳距離[34]。

近年來,利用分子標記技術(shù)從DNA水平上對牧草各品種間的親緣關(guān)系、起源及進化等進行了研究探討,取得了較大進展。盛紅梅等[35]應(yīng)用RAPD技術(shù)對甘肅省內(nèi)的23種忍冬屬植物的遺傳多樣性及其種間關(guān)系進行了探討,表明其具有較為豐富的遺傳多樣性。田志宏等[36]采用RAPD技術(shù)對從美國引進的12份草地早熟禾品種進行了遺傳多樣性分析,結(jié)果表明RAPD技術(shù)能夠有效地檢測出草地早熟禾品種間的遺傳變異,具有較高的遺傳多樣性。張吉宇等[37]利用RAPD標記分析胡枝子屬14個野生居群遺傳多樣性,揭示了居群間存在較高的遺傳多樣性。孫建萍等[38]利用微衛(wèi)星分子標記對我國16份披堿草進行遺傳多樣性研究,結(jié)果表明披堿草的遺傳多樣性主要存在于居群內(nèi)。。魏臻武等從60多對SSR引物中篩選出8對有效引物,并檢測出苜蓿不同基因組相當(dāng)豐富的遺傳多樣性[39,40]。在對多年生黑麥草(Loliumperenne)的研究中,Jones等也檢測到了SSR標記高達67%的多態(tài)性[41]。

Ferdinandez等用 RAPD標記鑒定無芒雀麥草(Bromus inermis Leyss)和草地雀麥草及其雜交雀麥草間的親緣關(guān)系,結(jié)果表明,雜交雀麥草與無芒雀麥草間遺傳變異小,與草地雀麥草間遺傳變異大,而親本間遺傳變異最大。Weaver等人通過DNA擴增指紋,用任意的核苷酸序列作為引物鑒定假儉草(Eremochloa ophiuroides)的遺傳多樣性及其變異情況,以便找到該品種的原始種。Huf等用草地早熟禾(Poap L.)為研究材料,通過改進銀染聚丙烯酰胺凝膠的方法,利用RAPD標記確定了源于兼性無融合生殖變異株的遺傳起源[42]。

2.3 品種鑒定與純度分析

牧草和草坪草品種大多是由野生種馴化而來,或是遺傳背景相近品種的雜交組合,而鑒定品種純度的常規(guī)方法是根據(jù)田間表型性狀進行鑒定,隨著登記品種的增多,利用形態(tài)標記這一傳統(tǒng)方法來區(qū)分品種已變得十分困難,生化標記方法鑒定品種真實性和純度時受組織或器官特異性差異影響,且成本比較高;利用DNA指紋分析技術(shù)對牧草品種進行分析鑒定,不僅不受牧草生長環(huán)境、發(fā)育階段和組織的影響,而且能夠簡便、快速、省時和準確地鑒定不同的品種、品系及其相互之間的親緣關(guān)系[43,44]。

劉公社等利用SSR標記對黑麥草屬和羊茅屬的品種進行鑒定,證明[AC(GACA)4]能有效地區(qū)分黑麥草和羊茅[45]。Akagi等用17個SSR標記有效地區(qū)分了59個親緣關(guān)系密切的日本粳稻品種[46]。鄭玉紅等對采自中國不同地區(qū)的6份狗牙根(Cynodon dactylon)優(yōu)良選系進行了RAPD分子標記實驗的結(jié)果表明,RAPD分子標記可成功地用于中國狗牙根優(yōu)良選系遺傳多樣性的研究及品種鑒定[47]。鐘小仙等利用RAPD技術(shù)對美洲狼尾草不育系23A、23DA、恢復(fù)系3B-6及其相應(yīng)的3個Fl雜交種基因組進行多態(tài)性分析,其中條帶清晰且重復(fù)性好的引物S369,為美洲狼尾草親本材料及其雜交種鑒定和純度分析提供了一種快速、準確的檢測手段[48]。傅小霞等利用RAPD標記鑒定技術(shù)柱花草種子,首次為柱花草種子的品種鑒定提供了完整的分子標記檢測方法[49]。毛培勝等采用分子標記方法進行紫花苜蓿品種鑒定的結(jié)果表明:RAPD分子標記引物的篩選、標記程序的完善,確定品種特異性標記譜帶,可以用于進行紫花苜蓿品種的鑒定[50]。

2.4 加速和優(yōu)化育種進程

傳統(tǒng)的牧草育種方法是通過其表現(xiàn)型進行選擇,具有很大局限性。而分子標記輔助選擇是在DNA水平上進行的優(yōu)化選擇,克服了傳統(tǒng)育種的盲目性,具有不受環(huán)境條件和植物生長發(fā)育階段影響的優(yōu)點,且檢測直接快速方便,可靠性強,并對牧草優(yōu)良的物理性狀、生理生化特性的連鎖基因進行標記、定位,并通過克隆測序?qū)擞浕蛑谱魈结?直接用于雜種早期選擇、抗性鑒定等方面。盡管從表面看分子標記輔助育種比傳統(tǒng)的形態(tài)選擇成本高,但是,成本/利益卻不高,特別是在處理復(fù)雜的性狀上展現(xiàn)了極有潛力的用處[51]。

國內(nèi)分子標記技術(shù)應(yīng)用于牧草育種研究僅處于起步階段?？鼓嫘杂N方面,楊青川等以中苜一號和耐鹽苜蓿大西洋為材料,應(yīng)用RAPD技術(shù),對14組280條隨機引物進行了篩選,為耐鹽苜蓿的耐鹽基因分子遺傳標記的研究奠定了基礎(chǔ)[52]?？共∮N方面,桂枝等運用RAPD技術(shù),采用集群分離分析法對5個苜蓿品種進行了抗褐斑病基因連鎖的分子標記研究,篩選出8個能夠同時在3個以上苜蓿品種內(nèi)的抗、感材料間顯示多態(tài)性的隨機引物[53]。

3 發(fā)展前景

分子標記已在牧草種質(zhì)資源遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建和基因定位、遺傳多樣性與親緣關(guān)系分析、品種鑒定與純度分析以及加速和優(yōu)化育種進程等領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。我國分子標記技術(shù)應(yīng)用在牧草種質(zhì)資源的研究方面起步較晚,無論在研究內(nèi)容上還是在研究方法上相對較少,因此,需要加大研究力度,投入更多的人力和財力,借鑒國外的研究成果,結(jié)合國內(nèi)的實際情況,把研究重點放在主要特色牧草資源上。分子生物學(xué)技術(shù)在不斷完善和進步,成本在不斷降低,其必將給牧草種質(zhì)資源的各方面研究帶來新的革命。

目前,分子標記主要應(yīng)用于牧草的基礎(chǔ)研究工作,預(yù)見在不久的將來,分子標記技術(shù)在牧草種質(zhì)資源以下幾個方面研究中將會產(chǎn)生深遠的影響:(1)開發(fā)利用豐富野生牧草種質(zhì)資源優(yōu)異基因方面,利用分子標記技術(shù)挖掘和鑒定與高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗相關(guān)的基因,進行精確定位、分離克隆及遺傳轉(zhuǎn)化。(2)在牧草大面積生產(chǎn)中,標記控制適宜當(dāng)?shù)貧夂驐l件的重要基因,提高牧草的產(chǎn)量、品質(zhì)和生態(tài)效益。(3)在利用分子標記輔助育種選擇方面,通過分子標記技術(shù)對牧草抗病、抗蟲、耐淹、抗旱、抗寒、耐鹽堿等抗逆性基因進行精確定位,結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù),將有利于培育出優(yōu)質(zhì)高抗的新品種。

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