胡火庚 汪成竹 陳昌福

三種致病菌粗脂多糖（LPS）對(duì)團(tuán)頭魴的免疫原性

胡火庚 汪成竹 陳昌福

胡火庚，江西省水產(chǎn)技術(shù)推廣站，高級(jí)工程師，330046，江西 南昌。

汪成竹，河南省信陽(yáng)農(nóng)業(yè)高等?？茖W(xué)校。

陳昌福，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院。

★ 農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（200803013）和973項(xiàng)目（2009CB118700）資助

國(guó)內(nèi)外大量研究表明，從革蘭氏陰性菌中提取的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）對(duì)養(yǎng)殖魚類具有比較強(qiáng)的免疫原性和良好的免疫保護(hù)作用。Kawai等（1987）采用溫酚法從鰻弧菌（Vibrio anguillarum）中提取的菌體LPS接種香魚（Plecoglossus altiveliss）后能使受免魚得到良好的免疫保護(hù)力。Salati等（1984）的研究證實(shí)，從遲緩愛德華菌（Edwardsilla tarda）中提取的菌體LPS對(duì)日本鰻鱺（Anguilla japonica）具有良好的免疫原性。陳昌福等（1997）先后利用從魚類多種致病菌中提取的粗LPS分別免疫接種鯉（Cyprinus carpio）、草魚（Ctenopharyngodon idellus） 和鱖（Siniperca chuatsi）等養(yǎng)殖魚類，均獲得了比較好的免疫效果。黃辨非等（2002）采用溫酚法從鰻弧菌（V.anguillarum）、哈維弧菌（V.harveyi）和副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）的菌體中提取的粗LPS分別接種異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）后，比較了3種致病弧菌菌體粗LPS對(duì)異育銀鯽的免疫原性的差別。

隨著網(wǎng)箱飼養(yǎng)團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）的迅速發(fā)展，各種傳染性疾病的發(fā)生越來越頻繁，依靠藥物有效控制團(tuán)頭魴各種傳染性疾病的難度也越來越大。本研究利用從患病團(tuán)頭魴體內(nèi)分離的柱狀黃桿菌（Flavobacterium columnare）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）和溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria），分別提取其菌體LPS后，對(duì)網(wǎng)箱飼養(yǎng)的團(tuán)頭魴進(jìn)行了免疫接種試驗(yàn)，旨在為研制預(yù)防團(tuán)頭魴的魚用疫苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株及其培養(yǎng)

用于本研究的柱狀黃桿菌、嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌由江西省南昌縣某水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)的患病團(tuán)頭魴體內(nèi)分離得到。將保存的菌種先在腦心浸液培養(yǎng)基（BHI，Difco產(chǎn)品）中 25℃條件下，預(yù)培養(yǎng) 24 h，再轉(zhuǎn)接種于淡水瓊脂培養(yǎng)基（FWA）中，培養(yǎng)48 h后，離心集菌并以滅菌生理鹽水清洗3次，稀釋菌液至一定的濃度，加入終濃度為0.5%的福爾馬林，冷藏備用。

1.1.2 菌體粗LPS的提取

參照Westphal等（1965）的方法分別從柱狀黃桿菌、嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌3種供試菌中提取粗 LPS（分別簡(jiǎn)稱為 fc-LPS、ah-LPS 和 as-LPS）。

1.1.3 供試魚

供試魚飼養(yǎng)于武漢市洪山區(qū)湯遜湖的網(wǎng)箱中，網(wǎng)箱規(guī)格為3.0m×3.0m×2.0m。每個(gè)網(wǎng)箱內(nèi)放養(yǎng)500尾，平均體重為324.0 g。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)魚分組與飼養(yǎng)管理

從環(huán)境條件大致相同、同一個(gè)魚排的30個(gè)相同規(guī)格網(wǎng)箱中隨機(jī)選取4個(gè)網(wǎng)箱（分別作為Ⅰ～Ⅳ組）用于本試驗(yàn)。在開始試驗(yàn)前，利用過篩法從全魚排網(wǎng)箱飼養(yǎng)的團(tuán)頭魴中選擇規(guī)格相近的魚體放于擬做試驗(yàn)的4個(gè)網(wǎng)箱中。每天投喂相當(dāng)于魚體重3.0%的飼料，早、晚各1次。所用飼料為武漢海大飼料公司生產(chǎn)的團(tuán)頭魴專用飼料。試驗(yàn)期間溫度變化于18.5～27.5℃之間。

1.2.2 免疫接種

用滅菌生理鹽水分別將3種菌體粗LPS調(diào)整至5.0mg/ml的濃度后，按25.0mg/kg魚體重的接種量，以注射法經(jīng)供試魚的胸鰭基部接種，每1種菌體LPS溶液各注射500尾供試魚放入同一個(gè)網(wǎng)箱，分別作為3個(gè)試驗(yàn)組。另外以注射大致相同劑量生理鹽水的500尾團(tuán)頭魴，放入另一個(gè)網(wǎng)箱內(nèi)作為對(duì)照組。

1.2.3 采血

分別于免疫接種后第7、14、21和28 d，從每個(gè)試驗(yàn)組和對(duì)照組網(wǎng)箱中分別隨機(jī)抽取15尾魚采血。將每尾魚的血液均分為2份，1份置常溫下凝血后分離血清，供檢測(cè)凝集抗體效價(jià)和交叉凝集抗體效價(jià)用；另1份以肝素抗凝，供分離白細(xì)胞測(cè)定其吞噬活性之用。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 凝集抗體效價(jià)的測(cè)定

采用血凝板依常法進(jìn)行。反應(yīng)抗原分別采用經(jīng)福爾馬林滅活的F.columnare（簡(jiǎn)稱F-FC）、A.hydrophila（簡(jiǎn)稱 F-AH）和 A.sobria（簡(jiǎn)稱 F-AS）。

1.3.2 吞噬活性的測(cè)定

對(duì)采血后的供試魚立即解剖，取出頭腎，在L-15培養(yǎng)基（Difco產(chǎn)品）中用滅菌剪刀將頭腎剪碎，再用白金網(wǎng)過濾，去除組織塊。以600 r/min離心10min，將濾液中的細(xì)胞清洗3次后，離心回收細(xì)胞并用L-15培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整至1.0×105個(gè)細(xì)胞/ml，作為頭腎吞噬細(xì)胞液；將抗凝血以600 r/min的速度離心5min，分離收集白細(xì)胞層，用L-15培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0×105個(gè)細(xì)胞/m l，作為血液中吞噬細(xì)胞液。分別在0.5m l頭腎和血液吞噬細(xì)胞液中添加0.2 m l經(jīng)福爾馬林滅活的金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，簡(jiǎn)稱F-SA），置25℃水浴中孵育40 min后，涂片，Giemsa染色，鏡檢。依照下式計(jì)算各種吞噬細(xì)胞的吞噬百分比（phagocytic percentage，PP）和吞噬指數(shù)（phagocytic index，PI）。

1.3.3 殺菌活性的測(cè)定

參照陳昌福（1997）的方法進(jìn)行。即在盛有0.5ml頭腎或血液吞噬細(xì)胞液的試管中分別添加0.2 ml A.hydrophila活菌，在25.0℃水浴中孵育40min后，加入1.0ml L-15培養(yǎng)基，以600 r/min離心10min的方法清洗吞噬細(xì)胞3次，棄上清后再添加0.3ml 0.2%的Tween 20（Difco產(chǎn)品）水溶液并搖動(dòng)5min，使吞噬細(xì)胞破碎，加入2.0ml BHI，在25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，每支試管中加入0.05 ml濃度為5.0 mg/ml的MTT（Monotetrazolium，日水產(chǎn)品）溶液，搖動(dòng)15 min后用751分光光度計(jì)于600 nm處測(cè)定光密度值，并且依下式評(píng)價(jià)受免和對(duì)照魚的吞噬細(xì)胞對(duì)A.hydrophila活菌的殺菌活性（bactericidalactivity，BA）。

殺菌活性（BA）＝

試驗(yàn)魚吞噬細(xì)胞還原的MTT的光密度值。

對(duì)照魚吞噬細(xì)胞還原的MTT的光密度值

2 結(jié)果與分析

2.1 凝集抗體效價(jià)

受免和對(duì)照?qǐng)F(tuán)頭魴血清中凝集抗體效價(jià)和交叉凝集抗體效價(jià)的測(cè)定結(jié)果如表1所示。從表1可以看出，用3種不同的菌體粗LPS注射接種團(tuán)頭魴后，受免魚血清中凝集抗體效價(jià)和交叉凝集抗體效價(jià)均迅速地上升，各受免組團(tuán)頭魴血清中的凝集抗體效價(jià)和交叉凝集抗體效價(jià)均于接種后第14 d內(nèi)達(dá)到高峰，隨后逐漸下降，而對(duì)照組團(tuán)頭魴血清中的凝集抗體效價(jià)和交叉凝集抗體效價(jià)都很低。受免組和對(duì)照組團(tuán)頭魴血清中的凝集和交叉凝集抗體效價(jià)水平具有極顯著差異（P＜0.01），而3 個(gè)免疫組之間則差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 血液和頭腎中吞噬細(xì)胞的吞噬活性

受免和對(duì)照?qǐng)F(tuán)頭魴血液和頭腎中吞噬細(xì)胞對(duì)FSA的吞噬活性測(cè)定結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，采用3種不同的菌體粗LPS注射接種團(tuán)頭魴后，多數(shù)受免魚血液和頭腎中吞噬細(xì)胞的PP和PI逐漸上升，并且總的趨勢(shì)是于免疫接種后14 d左右達(dá)到峰值，受免魚血液和頭腎中吞噬細(xì)胞的PP和PI值，均極顯著地高于對(duì)照組（P＜0.01）。

表1 受免和對(duì)照?qǐng)F(tuán)頭魴血清中凝集抗體效價(jià)和交叉凝集抗體效價(jià)

表2 受免和對(duì)照?qǐng)F(tuán)頭魴血液和頭腎中吞噬細(xì)胞對(duì)F-SA的吞噬活性

2.3 血液和頭腎中吞噬細(xì)胞的殺菌活性（見表3）

對(duì)受免和對(duì)照?qǐng)F(tuán)頭魴血液和頭腎中吞噬細(xì)胞的殺菌活性的測(cè)定結(jié)果如表3所示。由表3可以看出，經(jīng)3種不同菌體粗LPS注射接種團(tuán)頭魴后，受免團(tuán)頭魴血液和頭腎中吞噬細(xì)胞的殺菌活性均顯著地高于對(duì)照組（P＜0.05），但是各免疫組之間的差異則不顯著（P＞0.05）。

表3 受免和對(duì)照?qǐng)F(tuán)頭魴血液和頭腎中吞噬細(xì)胞的殺菌活性

3 討論

關(guān)于魚類致病菌菌體粗LPS對(duì)魚類免疫原性的研究已有較多報(bào)道。但是，除黃辨非等（2002）對(duì)異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）的研究中注意到了3種弧菌的LPS存在共同抗原外，其他的研究者尚未注意到各種魚類致病菌菌體粗LPS上的共同抗原問題。

陳昌福等（2000）的研究證明，當(dāng)對(duì)鱖（Siniperca chuatsi）接種F.columnare或者遲緩愛德華菌（E.tarda）的菌體粗LPS后，受免魚能增強(qiáng)對(duì)A.hydrophila活菌攻毒的抵抗力。在本研究中，經(jīng)接種3種不同細(xì)菌的菌體粗LPS后，受免團(tuán)頭魴的血清中均產(chǎn)生了不同水平的交叉凝集抗體效價(jià)，說明在3種細(xì)菌的菌體粗LPS上存在著一定數(shù)量的共同抗原，并且這些共同抗原對(duì)供試魚具有較強(qiáng)的免疫原性。至于這些共同抗原能否誘導(dǎo)受免魚類產(chǎn)生交叉免疫保護(hù)力，尚有待進(jìn)一步研究。

對(duì)魚類接種疫苗后觀察其免疫應(yīng)答水平時(shí)，大多數(shù)研究者是將試驗(yàn)魚飼養(yǎng)在人工控制的實(shí)驗(yàn)室水族箱中進(jìn)行的，但是，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)過多的人為因素對(duì)實(shí)驗(yàn)魚造成的各種脅迫，對(duì)實(shí)驗(yàn)魚免疫應(yīng)答過程的影響往往是研究者難以預(yù)測(cè)和準(zhǔn)確評(píng)估的。本研究中將試驗(yàn)魚飼養(yǎng)在野外的生產(chǎn)性網(wǎng)箱中進(jìn)行，雖然難以完全避免人為因素對(duì)試驗(yàn)魚免疫應(yīng)答過程的影響，但是，如果采用本試驗(yàn)結(jié)果評(píng)估魚用疫苗在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用狀況，就可能因?yàn)橛行У販p少了試驗(yàn)誤差而更為準(zhǔn)確。

12篇，刊略，需者可函索）

（編輯：沈桂宇，guiyush@126.com）

2010-02-22